Genômica e Proteômica 1) Genômica Estrutural O que é Genômica ? Subdivisão da genética de mapeamento, sequenciamento e análise do funcionamento de genomas inteiros (Thomas Roderick, 1986) Revista Genômica 1) Estrutural 2) Funcional Visa a caracterização física do genoma Caracterização do Transcriptoma (transcritos produzido) Caracterização do Proteoma (proteínas codificadas) 1) Genômica Estrutural Mapas Cromossômicos: Níveis crescentes de resolução Cascatas de regulação da expressão gênica Os processos de diferenciação celular envolvem a participação de genes reguladores chave que controlam a expressão de genes específicos para a formação de cada órgaão ou tecido. Dentre os genes ativados, existem alguns que tb possuem afç de ativar outros genes. Genes constitutivos – expressos na maioria das células. São responsáveis pela pela manutenção de fçs essencias. Genes regulados – expresso em fases do desenvolv, em resposta a estímulos ambientais, etc. genes induzíveis genes tecido-específicos Atribuição de loci a cromossomos específicos localização destes loci nos cromossomos obtenção das sequências nucleotídicas destes loci Genômica e Proteômica

1) Genômica Estrutural Mapeamento Meiótico por Recombinação Cascatas de regulação da expressão gênica Os processos de diferenciação celular envolvem a participação de genes reguladores chave que controlam a expressão de genes específicos para a formação de cada órgaão ou tecido. Dentre os genes ativados, existem alguns que tb possuem afç de ativar outros genes. Genes constitutivos – expressos na maioria das células. São responsáveis pela pela manutenção de fçs essencias. Genes regulados – expresso em fases do desenvolv, em resposta a estímulos ambientais, etc. genes induzíveis genes tecido-específicos Inicialmente utilizava-se marcadores fenotípicos qualitativos Limitações: - precisa realizar cruzamentos controlados - necessidade de obtenção de um grande número de descendentes É aplicado principalmente a organismos experimentais (Drosophila, Arabidopsis, Neurospora, etc) Nestes organismos, existem muitos marcadores fenotípicos já mapeados Entretanto, intervalos entre marcadores ainda era grande Intervalos não podiam ser mapeados por análise de ligação pois não haviam outros marcadores nestas regiões Baseado na análise da frequência de recombinantes Genômica e Proteômica

Ex. 1: Uso de marcadores Microssatélite 1) Genômica Estrutural Mapeamento Meiótico por Recombinação Marcadores Moleculares Sítio de heterozigose para algum tipo de variação neutra de DNA Preenchem os intervalos entre os marcadores fenotípicos RFLPs (Restriction Fragment-Length Polymorphisms) Minissatélite Microssatélite RAPDs (Randonly Amplified Polymorphic DNAs) AFLPs (Amplified Fragment-Length Polymorphisms) SSCPs (Single-Strand Conformational Polymorphisms) DGGEs (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) SNPs (Single Nucleotide Polymorphysms) Ex. 1: Uso de marcadores Microssatélite Cascatas de regulação da expressão gênica Os processos de diferenciação celular envolvem a participação de genes reguladores chave que controlam a expressão de genes específicos para a formação de cada órgaão ou tecido. Dentre os genes ativados, existem alguns que tb possuem afç de ativar outros genes. Genes constitutivos – expressos na maioria das células. São responsáveis pela pela manutenção de fçs essencias. Genes regulados – expresso em fases do desenvolv, em resposta a estímulos ambientais, etc. genes induzíveis genes tecido-específicos Genômica e Proteômica

Posicionamento de loci em Mapas Citológicos: 1) Genômica Estrutural Posicionamento de loci em Mapas Citológicos: Hibridização in situ Marcação com sonda radioativa (cromossomo politênico de Drosophila) Marcação com sonda fluorescente – FISH (Cromossomo humano 11) Cascatas de regulação da expressão gênica Os processos de diferenciação celular envolvem a participação de genes reguladores chave que controlam a expressão de genes específicos para a formação de cada órgaão ou tecido. Dentre os genes ativados, existem alguns que tb possuem afç de ativar outros genes. Genes constitutivos – expressos na maioria das células. São responsáveis pela pela manutenção de fçs essencias. Genes regulados – expresso em fases do desenvolv, em resposta a estímulos ambientais, etc. genes induzíveis genes tecido-específicos 1) Genômica Estrutural Mapeamento Físico É assim chamado pois é obtido pela manipulação direta de fragmentos de DNA, material físico do genoma Meta: identificar um conjunto de fragmentos clonados superpostos que englobem todo o cromossomo ou o genoma Biblioteca genômica Clones RFLP Grupos superpostos de clones (contigs) Genômica e Proteômica

1) Genômica Estrutural 1) Genômica Estrutural Mapeamento Físico Ordenamento dos clones por clivagem com enzimas de restrição Cascatas de regulação da expressão gênica Os processos de diferenciação celular envolvem a participação de genes reguladores chave que controlam a expressão de genes específicos para a formação de cada órgaão ou tecido. Dentre os genes ativados, existem alguns que tb possuem afç de ativar outros genes. Genes constitutivos – expressos na maioria das células. São responsáveis pela pela manutenção de fçs essencias. Genes regulados – expresso em fases do desenvolv, em resposta a estímulos ambientais, etc. genes induzíveis genes tecido-específicos 1) Genômica Estrutural Mapeamento Físico: Ordenamento por FISH Marcação com sonda fluorescente – FISH (Cromossomo humano 11) Marcação com sonda fluorescente - FISH Ordenamento dos clones por FISH Mapa Citológico cromossomo 11 Mapa Citológico cromossomo 11 Genômica e Proteômica

Mapa de Ultra-Estrutura: Sequenciamento 1) Genômica Estrutural Mapa de Ultra-Estrutura: Sequenciamento Estratégias: 1) Sequenciamento aleatório de clones: 2) Sequenciamento de clones ordenados 1) Sequenciamento aleatório de clones: - DNA é fracionado e clonado aleatóriamente - As pontas dos clones são sequenciadas - As regiões sequenciadas são usadas para ordenar os clones Cascatas de regulação da expressão gênica Os processos de diferenciação celular envolvem a participação de genes reguladores chave que controlam a expressão de genes específicos para a formação de cada órgaão ou tecido. Dentre os genes ativados, existem alguns que tb possuem afç de ativar outros genes. Genes constitutivos – expressos na maioria das células. São responsáveis pela pela manutenção de fçs essencias. Genes regulados – expresso em fases do desenvolv, em resposta a estímulos ambientais, etc. genes induzíveis genes tecido-específicos 2) Sequenciamento de clones ordenados clones em YAC ordenados subclonagem em BACs BACs são novamente ordenados (STS) subclonagem de inserções menores sequenciamento aleatório dos clones Genômica e Proteômica

2) Genômica Funcional Dados de sequências em larga escala são o começo da genômica funcional Algumas das análises que podem ser feitas: Caracterização do proteoma por análise de ORFs Perturbação gênica por nocaute Silenciamento gênico por Interferência do RNA Estudo das interações gênicas pelo sistema duplo-híbrido Análise da expressão gênica através de MicroArranjos de DNA Uso da proteína fluorescente verde (GFP) para localização in vivo de proteínas a) Caracterização do proteoma por análise de ORF (sequências abertas de leitura) Softwares de previsão analisam as sequências de DNA - Examinam os 6 possíveis quadros de leitura - Buscam sequências com códons de início e término de tradução - Análise da função da ORF através da busca por sequências homólogas em bancos de dados Ex.: Distribuição provisória dos genes pode ser deduzida Cascatas de regulação da expressão gênica Os processos de diferenciação celular envolvem a participação de genes reguladores chave que controlam a expressão de genes específicos para a formação de cada órgaão ou tecido. Dentre os genes ativados, existem alguns que tb possuem afç de ativar outros genes. Genes constitutivos – expressos na maioria das células. São responsáveis pela pela manutenção de fçs essencias. Genes regulados – expresso em fases do desenvolv, em resposta a estímulos ambientais, etc. genes induzíveis genes tecido-específicos Genômica e Proteômica

2) Genômica Funcional b) Perturbação gênica por nocaute Investiga a função da ORF Inativação do gene (nocaute) por mutagenese in vitro procura de qualquer fenótipo mutante Mais da metade das ORFs inativadas não apresentam efeitos fenotípicos c) Silenciamento gênico por interferência do RNA (RNAi) Investiga a função da ORF Duplas fitas de RNA são reconhecidas e clivadas. Silencia o gene procura de qualquer fenótipo mutante Cascatas de regulação da expressão gênica Os processos de diferenciação celular envolvem a participação de genes reguladores chave que controlam a expressão de genes específicos para a formação de cada órgaão ou tecido. Dentre os genes ativados, existem alguns que tb possuem afç de ativar outros genes. Genes constitutivos – expressos na maioria das células. São responsáveis pela pela manutenção de fçs essencias. Genes regulados – expresso em fases do desenvolv, em resposta a estímulos ambientais, etc. genes induzíveis genes tecido-específicos Genômica e Proteômica

2) Genômica Funcional d) Estudo das interações gênicas pelo sistema duplo-híbrido Investiga a interação entre proteínas Proteína GAL4 de leveduras tem 2 domínios: a) ligação ao DNA b) ativação Cascatas de regulação da expressão gênica Os processos de diferenciação celular envolvem a participação de genes reguladores chave que controlam a expressão de genes específicos para a formação de cada órgaão ou tecido. Dentre os genes ativados, existem alguns que tb possuem afç de ativar outros genes. Genes constitutivos – expressos na maioria das células. São responsáveis pela pela manutenção de fçs essencias. Genes regulados – expresso em fases do desenvolv, em resposta a estímulos ambientais, etc. genes induzíveis genes tecido-específicos Genômica e Proteômica

e) Análise da expressão gênica através de MicroArranjos de DNA 2) Genômica Funcional e) Análise da expressão gênica através de MicroArranjos de DNA Avalia a expressão gênica em organismos, tecidos ou células em diferentes situações fisiológicas ou patológica Analisa o nível de expressão de milhares de genes simultaneamente Necessita confirmação posterior por Northern-blotting ou RT-PCR Quantitativo. Cascatas de regulação da expressão gênica Os processos de diferenciação celular envolvem a participação de genes reguladores chave que controlam a expressão de genes específicos para a formação de cada órgaão ou tecido. Dentre os genes ativados, existem alguns que tb possuem afç de ativar outros genes. Genes constitutivos – expressos na maioria das células. São responsáveis pela pela manutenção de fçs essencias. Genes regulados – expresso em fases do desenvolv, em resposta a estímulos ambientais, etc. genes induzíveis genes tecido-específicos Genômica e Proteômica

2) Genômica Funcional f) Uso da proteína fluorescente verde (GFP) para localização in vivo de proteínas Fusão traducional entre o gene de interesse e a proteína GFP Monitora a sintese e localização de proteínas específicas in vivo Cascatas de regulação da expressão gênica Os processos de diferenciação celular envolvem a participação de genes reguladores chave que controlam a expressão de genes específicos para a formação de cada órgaão ou tecido. Dentre os genes ativados, existem alguns que tb possuem afç de ativar outros genes. Genes constitutivos – expressos na maioria das células. São responsáveis pela pela manutenção de fçs essencias. Genes regulados – expresso em fases do desenvolv, em resposta a estímulos ambientais, etc. genes induzíveis genes tecido-específicos Genômica e Proteômica