Purificação de Produtos Biotecnológicos ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA EEL / USP Purificação de Produtos Biotecnológicos Disciplina: Engenharia Bioquímica II A Programa de Aperfeiçoamento de Ensino (PAE): Livia Carneiro Profº Arnaldo Márcio

Etapas de um Processo de Purificação

Etapa do processo Operações unitárias Princípio Clarificação   Filtração convencional Tamanho de partículas Centrifugação Tamanho e densidade de partículas Filtração tangencial (membranas) Floculação Hidrofobicidade de partículas Rompimento de células H omegeneização Cisalhamento Ultra-som Moagem em moinho de bolas Rompimento químico ou enzimático Hidrólise, solubilização ou desidratação de moléculas que compõem a parede ou a membrana celular Purificação de baixa resolução Precipitação Solubilidade U Itrafiltração (membranas) Massa molar e raio hidrodinâmico de moléculas Extração em sistemas de duas fases líquidas Solubilidade, massa molar Purificação de alta resolução Cromatografia de troca-iônica Tipo e densidade de carga na superfície da biomolécula Cromatografia de afinidade (biológica ou química) Sítios específicos da superfície de uma proteína (adsorção) Cromatografia de imunoafinidade Sítios específicos da superfície de uma proteína (adsorção antígeno/anticorpo) Cromatografia de interação hidrofóbica Hidrofobicidade Cromatografia de exclusão molecular Massa molar Membranas adsortivas Massa molar e características para adsorção ou sítios específicos da superfície de uma proteína Tratamentos finais Cristalização Solubilidade e características de equilíbrio líquido-sólido Liofi I ização Características de equilíbrio líquido-sólido Secagem

Rompimento Celular Produtos Intracelulares Rompimento Celular Suspensão Celular Clarificação Rompimento Celular Produtos Intracelulares Produtos intracelulares tornam o processo de purificação de biomoléculas mais difícil em comparação com produtos extracelulares devido à necessidade do rompimento

Aplicados após a separação e lavagem das células; Células animais (possuem apenas membrana), fácil rompimento com baixa força de cisalhamento; Ex.: Células animais: rompidas por simples variação da pressão osmótica do meio, adição de detergentes ou aplicação de ultra-som de baixa intensidade

Forma mais adequada de Rompimento? Tipo de microrganismo Tamanho da célula; Tolerância a tensões de cisalhamento; Necessidade de controle de temperatura; Gasto de energia;

Parede Celular

Métodos de Rompimento Celular Mecânicos Homogeneizador de alta pressão Moinho de bolas Ultrassom Não-mecânicos Choque osmótico Congelamento-descongelamento Aquecimento Secagem Químicos Álcalis Solventes Detergentes Ácidos Enzimáticos Lize enzimática

Homogeneizador a alta pressão Cavitação Turbulência Cisalhamento

Mecânico - Homogeneizador a alta pressão Este tipo de rompimento provoca aumento da temperatura do meio, por isso necessita de sistema de refrigeração Pressões utilizadas podem variar de 5000 a 20000 psi, velocidades de alimentação da ordem de 180 a 280 m/s e concentrações celulares de 450 a 750 g/L (massa úmida).

Mecânico - Homogeneizador a alta pressão O desempenho pode ser afetado por: Pressão de operação; Velocidade de alimentação; Temperatura; Estado fisiológico do microrganismo; Condições de cultivo; Tipo de célula e sua concentração. tamanho das células (maior => rompimento mais fácil) pressão (maior => maior eficiência) número de passagens (múltiplas etapas aumenta o ren-dimento)

Existe um modelo matemático para avaliar o rompimento, que neste caso é de 1a ordem em relação ao número de passagens e de potência em relação à pressão de trabalho:

  log Rm   =    k . N . Pa (Rm – R) onde: Rm é a concentração máxima de proteína disponível para ser liberada (g/L) R é a concentração de proteina liberada (g/L) k é a constante de velocidade que depende de T, X e do tipo de célula N é o número de passagens P é a pressão a é constante que depende do tipo de microrganismo e das condições de crescimento (varia de 0,86 a 2,9) (tabela)

Mecânico – Moinho de Bolas Consiste na passagem da suspensão celular por uma câmara de trituração (vertical ou horizontal) provida de um eixo com discos de agitação e preenchida com esferas de vidro. O rompimento ocorre devido à força de cisalhamento aplicada pelas esferas de vidro contra a parede celular das células.

Mecânico – Moinho de Bolas

Mecânico – Ultra-som O rompimento ocorre quando ondas sonoras (~20kHz), são convertidas em vibrações em um meio líquido e causam o fenômeno de cavitação. Escala de laboratório.

Mecânico - Ultrassom

Rompimentos Mecânicos Desvantagens: As elevadas forças de cisalhamento provocadas pelos rompimentos mecânicos podem destruir organelas celulares e desnaturar enzimas; Com o rompimento integral das células todo o conteúdo intracelular, incluindo ácidos nucléicos, organelas e fragmentos celulares é liberado junto com a molécula-alvo, sendo que o homogeneizado celular pode conter grande quantidade de contaminantes e elevada viscosidade.