Q-TOF Lucas Brandão UFRPE Quadrople Time of Fligth Mass Espectomotry Resultados Seqüenciamento de Proteínas

Espectrômetro de Massa Antes de começar, gostaria de introduzir esse pequeno conceito. Acredito que para quem já trabalha com analise e sequenciamento de proteinas é mais que trivial. Um sistema de espectometria de massa está dividido em tres partes 1: Fonte de ionização --> quem promove a ionização dos componentes a serem analizados Poderemos ter dois tipos principais de ionização a postiva e a negativa A fonte de ionização vai depender primordialmente de qual tipo de amostra estar se analisando, e.g, se é existe muito, sal, impurezas.... 2: Analisador --> é quem realizar a separação e he main function of the mass analyser is to separate , or resolve , the I Quadrupole - quadrupole and quadrupole - time-of-flight mass spectrometers generate low energy fragmentations with fewer types of side-chain fragmentations.

Existem diversas plataformas para análise em espectrometria de massa Várias configurações possíveis. A primeira pergunta Qual a diferença principal nos resultados entre os q-TOF para outras plataformas? O Slide anterior demonstra que temos vária plataformas e várias configurações possiveis!

However, the quadrupole TOF system was approximately fivefold more sensitive (1 fmol µl-1) than the triple-quadrupole instrument (5 fmol µl-1) when monitoring precursors of 216 Da (immonium ion of phosphotyrosine). The recently introduced Q2-pulsing function, which enhances the transmission of fragment ions of a selected m/z window from the collision cell into the TOF part, improved the sensitivity of precursor ion scans on a quadrupole TOF instrument. The selectivity of precursor ion scans is much better on quadrupole TOF systems than on triple quadrupoles because the high resolving power of the reflectron-TOF mass analyzer permits high-accuracy fragment ion selection at no expense of sensitivity. This minimizes interferences from other peptide fragment ions (a-, b-, and y- type) of the same nominal mass but with sufficient differences in their exact masses. As a result, the characteristic immonium ion of phosphotyrosine at m/z 216.043 can be utilized for the selective detection of tyrosine phosphorylated peptides.

Conclusão Q-TOF é muito mais sensível e com um poder de resolução muito maior MAIOR Sensibilidade Resolução acurácia

Quadropole-Time of Flight Devido as vantagens do espectro de TOF ele é utilizado como analisador Assim o quadropole pode ser usado como um filtro de massa que transmite apenas o íon parente (precursores) de interesse Q-TOF  pode ser utlizado tanto no modo MS, quanto no modo MS/MS Todos os espectros de massas obtidos tanto no MS, quanto MS/MS mode, são gravados com um TDC (time-to-digital converter)

Segunda pergunta: O que pode influenciar no resultado final de um q-TOF? Um sistema de espectometria de massa está dividido em tres partes 1: Fonte de ionização --> quem promove a ionização dos componentes a serem analizados Poderemos ter dois tipos principais de ionização a postiva e a negativa A fonte de ionização vai depender primordialmente de qual tipo de amostra estar se analisando, e.g, se é existe muito, sal, impurezas.... 2: Analisador --> é quem realizar a separação e he main function of the mass analyser is to separate , or resolve , the I Quadrupole - quadrupole and quadrupole - time-of-flight mass spectrometers generate low energy fragmentations with fewer types of side-chain fragmentations. Ionização positiva Ionização negativa TCD (time-to-digital converter)

Perguntas que se deve fazer Amostra: como será processada? Qual a procedência? Ionização: Positiva ou negativa? ESI ou MALDI? MAIOR Sensibilidade Resolução acurácia Descobrir se amostra tem grandes quantidades de sais, de outros aductos, contaminantes Caso tais perguntas não possam ser respondidas, nossos resultados não terão aquilo que queremos, maior sensibilidade, resolução e acurácia

Tipos de dados O principal tipo de dado que um espectrômetro de massas produz é um Espectro de massa Espectro de massa Cromatograma de massa selected ion monitoring (SIM), total ion current (TIC), selected reaction monitoring chromatogram (SRM)

Espectro de Massa MS Intensidade m/z

Resolução de Massa Definição: como a separação de duas massas pela espectrometria de massa. Sendo diretamente proporcional a acurácia M1 = 2,0157 M2 = 1,9793

Resolução de Massa Definição: como a separação de duas massas pela espectrometria de massa. Sendo diretamente proporcional a acurácia Quanto mais estreito o pico, maior é a resolução e maior a precisão em determinar m/z Full width at half maximum

Resolução de Massa M1 = 2,0157 M2 = 1,9793 M1-M2 = 0.0364

Comparação entre alta e baixa resolução Amostra com contaminantes mas apenas um único pico ALTA RESOLUÇÃO: Amostra com contaminante sendo mostrado com dois picos Baixa resolução: Um único pico

São gráficos que auxiliam na visualização da uma janela ou gate, e que permite também a escolha dos íons precursores

Seqüenciamento de Proteínas

Overview

Q-TOF Duas possibilidades Modo MS Modo MS/MS

Resultados em MS mode Produz um mapa peptídico (peptide map) ou PMF (peptide mass fingerprint) A proteína foi tripsinizada e depois analisada pela MS, sem a necessidade de ocorrer a separação (filtro) de íons Se a proteína já existe ele será encontrada no banco de dados.

Resultados em MS/MS mode Caso da caracterização pelo peptide map, não seja suficiente para determinar a proteína, Pode ser realizada a separação, fragmentação dos íons selecionados e em seguida ocorrer a analise pelo TOF.

Modo MS/MS Para fazer esta analise é necessário realizar a seleção do íon precursor Visto que o volume de dados impossibilita a aquisição de todos os íons num único espectro de massa Tomar a decisão de qual íon precursor deve ser selecionado

Critérios Intensidade Status da carga m/z Depois que ocorre a seleção do íon precursor, o modo MS/MS é automaticamente ligado Após um determinado período ou até que que um certo critério seja preenchido o sistema retorna ao modo MS E permanece nesse modo (MS) até que outro íon precursor seja novamente selecionado

Seleção e fragmentação

Ou seja... Uma corrida Dura 70mim 350 espectros de massa (TOF) Muitos picos: solventes, contaminantes e íons de peptídeos.

Primeiro tipo de resultado é o TIC Primeiro tipo de resultado é o TIC! O TIC (total ion current) é um grafico do tempo pela intensidade, No TIC por exemplo o pico de 33,27 minutos não nos fornece muitas informações. É apenas um único pico O espectometro de massa nesse mesmo tempo (33,27) minutos fornece vários picos. Onde um pico do de 903,481 foi selecionado para fazer o tandem MS Em outras palavras...é como se do TIC nos selecionássemos um pico para fazer o espectro em MS, e depois desses espectro MS, nos selecionássemos agora o pico (íon precursor) para fazer o MS/MS

“De novo” seqüenciamento O Papel da câmera de colisão

Seqüenciamento de Proteínas Para seqüenciar peptídeos é necessário realizar a sua fragmentação Podem existir 3 tipos de quebras de ligações diferentes NH-CH, CH-CO, e a ligação CO-NH Cada fragmentação da origem a duas espécies Uma neutra E outra carregada

A fragmentação acontece de maneira randômica e não seqüencial Além disso, algumas fragmentações são “preferidas” em relação a outras Por isso se encontra sinais de intensidades diferentes

Fragmentação peptídica e nomenclatura The b ions appear to extend from the amino terminus, sometimes called the N-terminus, and y ions appear to extend from the carboxyl terminus, or C-terminus.  While readily observed and diagnostic for b ions, a ions occur at a lower frequency and abundance in relation to b ions. The a ions are often used as a diagnostic for b ions, such that a-b pairs are often observed in fragment spectra.  The a-b pairs are separated by 28u, the mass for the carbonyl, C=O.   Íons b = no amino terminal y = no carboxil terminal A questão é que a fragmentação peptidica não acontece de forma sequencial

Tipos possiveis das quebradas das ligações

Íons b Íons y

Os íons b e y são utilizados para fazer o seqüenciamentos de um peptídeo.

OUTRO EXEMPLO

O Que fazer? 2 – olhar para o íon precursor: 1- Olhar para os imunoíons menores: Provaveis a.a. Presentes no peptídeo.

A ligação peptídica se quebra formando fragmentos típicos, como os íons b e y mostrados na figura, que terão massas diferentes de acordo com o radical R de cada aminoácido. A sequência obtida pela análise dos íons de uma série, por exemplo íons b, pode ser confirmada pela determinação da sequência feita a partir da série complementar de íons, no caso, íons y.

lucabrand@gmail.com OBRIGADO PELA ATENÇÃO