Correlações do Polimorfismo Genético do Vírus Linfotrópico de Células-T Humanas do Tipo 1 (HTLV-1) com o Polimorfismo dos genes do Hospedeiro Envolvidos no Desenvolvimento de TSP/HAM em Salvador. Pesquisador PRODOC: Luiz Carlos Alcântara Responsável Institucional: Bernardo Galvão-Castro Área: Medicina da Saúde – Sub-área: Epidemiologia molecular dos microorganismos

Objetivos Caracterização molecular do genoma proviral (U3-LTR) dos indivíduos infectados – Análise dos polimorfismos destas regiões relacionando os mesmos com o desenvolvimento de TSP/HAM; Caracterização molecular de genes do hospedeiro envolvidos no mecanismo de transativação por Tax (promotores de IL2, IL2-R, IL6) em indivíduos infectados assintomáticos e com TSP/HAM; Determinar a carga proviral nos indivíduos infectados, assintomáticos e com TSP/HAM, correlacionando estes resultados com as alterações genotípicas do hospedeiro.

QUAL A IMPORTÂNCIA DO ESTUDO DO POLIMORFISMO NA REGIÃO LTR VIRAL?

Ainda não se sabe porque a infecção pelo HTLV-I na maioria dos indivíduos resulta em uma infecção assintomática, enquanto poucos desenvolvem doença. Há poucas investigações que têm determinado correlações entre as manifestações clínicas e as alterações polimórficas nos genes provirais envolvidos na patogenicidade de Tax. Correlações entre o polimorfimo viral e o desenvolvimento de TSP/HAM no Japão. 5’ 3’ LTR GAG POL ENV X LTR 3’ 5’

ESTRUTURA DO LTR DO HTLV-I TATA box ATT 21-pb enhancer Sinal de poliadenilação

LTR GAG POL ENV X LTR 5’ 3’ LTR Transcrição 9032 pb TAX TRE - Elemento de resposta a TAX TAX/CREB CREB/ATF Transcrição 5’ 3’ U3 R U5 LTR TRE 1 TRE 2 TRE 3

POPULAÇÃO ESTUDADA ( n=88 ) Manuscrito em fase final de preparação ( Trabalho premiado da Jornada Científica do IOC/FIOCRUZ - 2005 ) POPULAÇÃO ESTUDADA ( n=88 ) CHTLV n= 6 TSP/HAM total= 36 FNN n= 30 CHTLV n= 34 ASSINTOMÁTICOS POPULAÇÃO GERAL n=3 total= 52 FNN n=12 ACRE n= 3

Menor 45 anos BAHIA AZUL n=3 total n=32 CHTLV n= 18 Menor 45 anos BAHIA AZUL n=3 total n=32 ASSINTOMÁTICOS FNN n= 9 ACRE n= 2 Maior 45 anos CHTLV n=16 FNN n=3 total=20 ACRE n=1

Análise da Freqüência de Mutações no gene LTR3’ (355 pb) RESULTADOS Análise da Freqüência de Mutações no gene LTR3’ (355 pb) *A significance level p<0.05 value was calculated by x2 test Table 1: Analysis of the frequency (%) of mutations in gene LTR3’ (355pb) between asymptomatic and symptomatic group. Comparing with the LTR ATK1 Japanese prototype: We detected a -632C>T mutation (19,2%; p=0.024).

RESULTADOS PRELIMINARES Análise da Freqüência de Mutações no gene LTR3’ (355 – 55 pb) * A significance level p <0.05 value was calculated by x2 test Table 2: Analysis of the frequency (%) of mutations in gene LTR3’(355pb) asym patients by age (up and down 45), comparing with the LTR ATK1 Japanese prototype: the -631-632C insertion was detected only in younger asym patients (25%, p=0.017).

A mutação -632C>T está presente no grupo assintomático (19,2%; p=0 Quando dividimos os pacientes assintomáticos pela idade (menor e maior que 45), uma inserção na posição -631C foi detectada somente no grupo com maior idade (25%, p=0.017). Estudos anteriores não encontraram correlações entre variações gênicas específicas e as diversas manifestações clínicas como ATLL e TSP/HAM (Osame et al., 2000). Em resumo, as mutações detectadas na região U3-LTR dos isolados do HTLV-1 poderiam estar relacionadas com a eficiência no mecanismo de transcrição viral e desenvolvimento da TSP/HAM. Na análise filogenética, todos os isolados da América Latina (do subtipo Cosmopolita, subgrupo Transcontinental) apresentaram as mutações nas posições –632 e –452, enquanto as mutações –595, -471 e –631 foram encontradas apenas fora deste grupamento.

QUAL A IMPORTÂNCIA DO ESTUDO DO POLIMORFISMO NOS PROMOTORES DAS CITOCINAS?

Ainda não se sabe porque a infecção pelo HTLV-I na maioria dos indivíduos resulta em uma infecção assintomática, enquanto poucos desenvolvem doença. Há poucas investigações que têm determinado correlações entre as manifestações clínicas e as alterações polimórficas nos genes das várias proteínas do hospedeiro envolvidas na patogenicidade de Tax. Estudo das propriedades moleculares e biológicas dessas proteínas nos indivíduos infectados fornecerá informações importantes sobre a patogenicidade do vírus; Correlações entre o polimorfimo nos genes do hospedeiro e o desenvolvimento de TSP/HAM no Japão.

 IL-6 IL-6 Células T citotóxicas Células B Potencializa a diferenciação na presença de IL-2 e IFN- Células T Células tronco hematopoiéticas Diferenciação e secreção de anticorpos Co-estimulante Atividade estimuladora de colônia Produção de IL-2 e de receptor de IL-2 http://www.nature.com/emboj/journal/v16/n5/thumbs/7590092f1.jpg http://adams.mgh.harvard.edu/Reeves/Research%20Images/Cytokinealign.jpg6

IL-6 - + + + + + glicocorticóides esteróides Ativação de macrófagos e células T IL-1 + Crescimento e diferenciação de células B TNF- IL-6 + Resposta de fase aguda fator de crescimento derivado de plaquetas + + + - Hematopoiese endotoxinas infecção viral glicocorticóides esteróides Normalmente IL-6 é expressa em níveis muito baixos. Infeçção, estresse, trauma:  níveis Menopausa e andropausa:  níveis Ershler WB & Keller ET, 2000

Vários estudos têm mostrado correlação: polimorfismos em genes de citocinas, entre elas IL-6, e susceptibilidade/ resistência a algumas doenças  lupus, artrite reumatóide, diabetes, artrite juvenil Polimorfismos de um único nucleotídeo: SNP  podem afetar a transcrição e a produção de citocinas fenótipos alto, intermediário e baixo produtor. Fishman et al, 1998

 ORIGEM GENÉTICA  Susceptibilidade a várias doença A freqüência dos polimorfismos de um único nucleotídeo (SNP) em genes de citocina e dos haplótipos podem diferir em populações com diferentes “backgrounds” (Cox et al. 2001; Meenagh et al. 2002; Darrin et al, 2001; Padyukov et al, 2001; Meenagh et al, 2002).  ORIGEM GENÉTICA  Susceptibilidade a várias doença  ETNIA X POLIMORFISMO X SUSCEPTIBILIDADE/RESISTÊNCIA A DOENÇAS

Representação esquemática da região 5’ do gene de IL-6, identificando os dois polimorfismos estudados e sítios de ligação para fatores de transcrição NFIL6 -158 -145 G A MRE NF-B TATA -174 -145 -73 -26 +1 -634 -597 -572 -174 G C G C G C Região de -180 a -123 é CRUCIAL para a transcrição de IL-6 induzida por vírus, segundos mensageiros e citocinas como IL-1 e TNF- Adaptado de Terry et al, 2000

A freqüência de –174G/C IL-6 é altamente heterogêneo entre diferentes populações (Fishman et al. 1998; Cox et al. 2001; Hoffman et al. 2002), mas a variante –634G/C IL-6 foi estudada apenas em amostras asiáticas (Nishimura et al. 2002; Kitamura et al. 2002; Yamada et al. 2003). http://www.icviacilea.it/pagine/giornalino/giornale

SNP –174 (GC): artrite reumatóide juvenil (Fishman et al, 1998), mal de Alzheimer (Licastra et al, 2003), hiperandrogenismo (Villuendas et al, 2002), susceptibilidade à diabetes tipo I (Jahromi et al, 2000), desenvolvimento de doenças cardiovasculares (Jenny et al, 2002). SNP -634 (GC): progressão da nefropatia diabética (Kitamura et al, 2002), diminuição da densidade mineral óssea (Ota et al, 2001).

Polimorfismos nos promotores de IL-6 X Pacientes infectados com HTLV-I População do Japão diferença na distribuição do polimorfismo no promotor de IL-6 na posição –634 entre indivíduos HTLV-I positivos, assintomáticos e com HAM/TSP (Nishimura e cols, 2002).

Pergunta: Existe associação desses Polimorfismos com a manifestação de TSP/HAM em indivíduos infectados com HTLV-1 de Salvador, Bahia, Brazil? ? G A GG GC CC T

Resultado 1: 3 populacões brasileiras 293 amostras coletadas entre 1997 e 2001: 100 da população geral de Salvador (Dourado et al. 2003); 94 doadores de sangue de descendentes de Alemães de Joinville (Grimaldi et al. 2002); 99 da tribo Tiriyo, fronteira Brasil/Suriname (Shindo et al. 2002) http://www.firststudy.ch/schools/images_gross/Baiana.jpg ETHNIC DIFFERENCES IN THE DISTRIBUTION OF INTERLEUKIN-6 POLYMORPHISMS AMONG THREE BRAZILIAN ETHNIC GROUPS. Gadelha, S.R. 1; Alcântara, L.C.J. 1,2; Costa, G.C.S. 1; Rios, D.L. 1; Galvão-Castro, B. 1,2 1 Laboratório Avançado de Saúde Pública/Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz/ Fundação Oswaldo Cruz, Salvador, Ba; 2 Escola Bahiana de Medicina e Saúde Pública/ Fundação Bahiana para o Desenvolvimento das Ciências. Key words: interleukin-6, polymorphisms, Brazilian populations http://www.nippobrasil.com.br/3.turismo.br/ http://www.giemmegi.org/images/indios-1.jpg

GG N (%) GC G C -634 Salvador 68 (68.0) 30 (30.0) 02 (2.0) 166 (83.0) Tabela 1.1 Percentagem genotípica e freqüência alélica de polimorfismos no promotor do gene de IL-6 IL-6 nas posições –634G/C e –174G/C em três populações Brasileiras. GG N (%) GC G C -634 Salvador 68 (68.0) 30 (30.0) 02 (2.0) 166 (83.0) 34 (17.0) Tiriyó 18 (18.2) 52 (52.5) 29 (29.3) 88 (44.4) 110 (55.6) Joinville 87 (92.6) 7 (7.4) - 181 (96.3) 07 (3.7) -174 71 (71.0) 25 (25.0) 04 (4.0) 167 (85.2) 29 (14.8) 94 (94.9) 5 (5.1) 193 (97.5) 5 (2.5) 43 (45.75) 33 (35.1) 18 (19.15) 119 (63.3) 69 (36.7) *2: 147.648, df: 2; p<0.001 (freqüência alélica) 2: 76.100, df: 2; p<0.001 (freqüência alélica).

*n= número de cromossomos Tabela 1.2. Freqüência dos haplótipos (combinação -634G/C e –174G/C) no promotor de IL-6 em três diferentes populações do Brasil     Salvador (n*=200) % Tiriyó (n*=198) Joinville (n*=188) -634G/-174G 66.5 42.8 59.1 -634G/-174C 16.5 1.6 37.2 -634C/-174G 17.0 54.8 3.7 -634C/-174C - 0.8   *n= número de cromossomos Salvador X Tiriyó: teste exato de Fisher: p<0,0001 Salvador X Joinvile: teste exato de Fisher: p<0,0001 Tiriyó X Joinvile: teste exato de Fisher: p<0,0001

Asiaticos/ Ameríndios Europeus/ Europeus-descendentes Tabela 1.3. Freqüências alélicas do polimorfismo –174 IL-6G>C nos principais grupos étnicos   Africanos/ Afro-descendentes % Asiaticos/ Ameríndios Europeus/ Europeus-descendentes IL-6-174 G 89.7 - 90.7*,# (83.5) 95.5 – 100#,**,##,& (97.5) 61.7# (63.3) C 9.3 - 10.3*,# (16.5) 0.2 - 4.5#,**,##,& (2.5) 38.3# (36.7)   Cox et al, 2001; # Hoffman et al, 2002; ** Hayakawa et al, 2002; ## Zhai et al, 200; & Fishman et al, 1998

Resultados e Discussão Polimorfismos X Grupos étnicos As frequências alélicas dos polimorfismos -634G/C p<0.001) e -174G/C (p<0.001) diferiram nas três populações. As frequências dos haplótipos variaram significativamente (p<0.0001) (Tabela 2). A maior frequência do alelo C na posição –174 em descendentes alemães de Joinville é consistente com aqueles demosntrados previamente em populações de Europeus (Tabela 3). Resultados e Discussão Polimorfismos X Grupos étnicos

A frequência do alelo C na posição –174 em amostras de Salvador, embora um pouco maior que aquelas previamente observadas em Africanos e Afro-Americanos, está próximo daqueles descritos (Table 3). Este achado é consistente com dados históricos que mostram a importância da contribuição africana e européia em Salvador (Alcantara et al., JAIDS 2003; Alcantara et al., AIDS 2006). A mais baixa frequência do alelo C na posição –174 foi encontrada na tribo Tiriyo. Esta frequência está na faixa observada para populações de origem asiática (Tabela 3). Estes dados são consistentes com a teoria da origem asiática dos Ameríndios, confirmando estudos anteriores em outros sistemas polimórficos (Ribeiro et al. 2003; Tokunaga et al. 2001).

 Poucos estudos têm investigado o polimorfismo –634G  C no promotor do gene de IL-6, e todos foram realizados em populações asiáticas. Este é o primeiro trabalho investigando este polimorfismo nestes grupos étnicos. Primeiro estudo verificando freqüência dos haplótipos (-634 GC e -174GC).

Resultados 2 Polimorfismos nos promotores dos genes da interleucina-6 em indivíduos infectados de SALVADOR. Existe associação com o desenvolvimento de doença neurológica? Manuscrito em fase final de preparação

 Tipo de estudo: Corte-transversal População alvo: Pacientes portadores de HTLV-I de demanda espontânea ou referenciada para o Centro de HTLV da Fundação Bahiana para o Desenvolvimento das Ciências (FBDC), confirmadamente positivos. Número de amostras analisadas: Indivíduos assintomáticos: 84 Pacientes com HAM/TSP: 26 Sintomáticos: 23 Soronegativos: 100

Idade (Mediana) HAM/TSP Oligosintomáticos 52.5 anos 51 anos Assintomáticos 38 anos Gênero HAM/TSP: 26 Masculino Feminino Assintomáticos: 84 09 (34.6%) 17 (65.4%) 31 (36.9%) 53 (63.1%) Oligosintomáticos: 24 09 (39.1%) 14 (60.9%)

Tabela 2.0. Frequência alélica do polimorfismos nas posições –634 e –174 do promotor de IL-6 em indivíduos infectados pelo HTLV-I atendidos no CHTLV/FIOCRUZ e indivíduos soronegativos provenientes de Salvador/ Bahia. HTLV-1 positivo N (%) HTLV-1 negativo Posição –634 Alelo G 246 (89.1) 166 (83) Alelo C 30 (10.9) 34 (17) Posição –174 240 (87.0) 167 (85.2) 36 (13.0) 29 (14.8) p>0.05

Tabela 2.1. Frequência alélica do polimorfismos nas posições –634 e –174 do promotor de IL-6 em indivíduos infectados pelo HTLV-I assintomáticos, oligosintomáticos, com HAM/TSP, e em indivíduos soronegativos Oligosintomático N% 43 (93.5) 06 (6.5) 36 (78.3) 10 (21.7) Assintomático N (%) HAM/TSP Posição –634 Alelo G 152 (90.5) 41 (78.8) Alelo C 16 (9.5) 11 (21.2) Posição –174 145 (86.3) 49 (94.2) 23 (13.7) 03 (5.8) -174GC -  do alelo G e  do alelo C nos indivíduos com HAM/TSP quando comparados com indivíduos oligosintomáticos (p=0.03). HAM/TSP X assintomáticos: p=0.14 -634GC -  Alelo C em HAM/TSP em relação aos assintomáticos (p=0.03) e oligosintomáticos (0.01). Assint X Oligos p=0.5

Tabela 2.2. Freqüência dos haplótipos (combinação -634G/C e –174G/C) no promotor de IL-6 nos indivíduos infectados pelo HTLV-1.   HAM/TSP n(%) OLIGOSSINTOMÁTICOS ASSINTOMÁTICOS -634GG/-174GG* 13 (50) 13 (56.5) 52 (61.9) -634GG/-174GC 01 (3.8) 05 (21.7) 13 (15.5) -634GG/-174CC - 02 (8.7) 03 (3.6) -634GC*/-174GG* 10 (38.5) -634GC*-174GC 02 (7.7) 01 (4.4) 02 (2.4) -634GC*/-174CC 01 (1.1) *genótipos relacionados a uma maior susceptibilidade a HAM/TSP

Monomórfico: todas as amostras foram GG -597 G/A Monomórfico: todas as amostras foram GG -572 G/C A três genótipos G/A (3.8%). Todos os demais G/G (96.2%) Promotor de IL-2: 20 amostras sequenciadas – fragmento de 310pb – região onde NF-B se liga 10 pacientes sintomáticos e 10 assintomáticos para o HTLV– nenhuma diferença/ nenhum polimorfismo detectado

http://www.monografias.com Carga proviral http://www.tthhivclinic.com/

HAM/TSP X Assintomáticos  14 pacientes HAM/TSP  53 assintomáticos Carga proviral (número de cópias/106cels) HAM/TSP X Assintomáticos número de cópias/106cels Mann-Whithney: p=0.0001

Carga proviral X Genótipo na posição -634 do promotor de IL-6 número de cópias/106cels número de cópias/106cels Mann-Whithney: p=0.97 Mann-Whithney: p=0.66 -634 G/C Mediana GG: 28665 cópias/106 céls GC: 20624 cópias/106 céls -174 G/C Mediana GG: 22189 cópias/106 céls GC: 20945 cópias/106 céls

Agradecimentos Bernardo Galvão Castro Filho (Coordenador) Sandra Rocha Gadelha (Doutorado) Sérgio de Araújo Pereira (Doutorado) Giselle Calazans de Souza Costa (Iniciação científica e mestrado) Cinara Carvalho(Apoio técnico); Simone Kashima (Colaborador) Anne-Mieke Vandamme (Colaborador) Ceuci Nunes (Clínica) Rodrigo Gaspar (Administração do projeto) Equipe do LASP/CPqGM e Centro de HTLV (FBDC/EBMSP) FAPESB