Coordenadora de estágio: Margarida Santana Quantos e qual o tipo de micróbios que existem em alguns miligramas de solo? Coordenadora de estágio: Margarida Santana Francisco Pascoal Ana Coelho Sara Medinas

A - Introdução Constituído por duas cadeias de nucleótidos; DNA Constituído por duas cadeias de nucleótidos; Cada nucleótido tem uma pentose, uma base fosfato, e uma base azotada; Todos os nucleótido são essencialmente iguais, variando apenas a base azotada.

DNA As duas cadeias formam uma dupla hélice e têm sentidos opostos, como está evidenciado na figura. Os nucleótidos das cadeias ligam-se através das bases azotadas. Adenina(A)-Timina(T) Guanina(G)- Citosina (C)

DNA As ligações G-C são triplas (mais fortes) As ligações A-T são duplas (mais fracas)

Bactérias Legenda: 1. DNA cromossómico; 2. Plasmídeos; 16s rDNA O genoma bacteriano é constituído por cromossoma e plasmídeo, o DNA codificante do RNA ribossomal (16s rDNA) está no cromossoma

Replicação do DNA é semi-conservativa

O PCR imita a replicação do DNA O que é necessário para o PCR? DNTP (nucleótidos no meio de reacção); Iniciadores; Enzima (DNA polimerase termo estável, isolada a partir de uma bactéria termofilica); Tampão com magnésio.

Após a primeira replicação cada molécula de DNA origina duas moléculas. Consequentemente, a quantidade de moléculas formadas será 2ⁿ, sendo n o número de replicações. Com este processo e a partir de pequenas quantidades de DNA, obtemos grandes quantidades – amplificação.

São necessários dois iniciadores, um “forward“ e um “reverse”. Nota: São necessários dois iniciadores, um “forward“ e um “reverse”. Os iniciadores a utilizar dependem da parte que se quer amplificar. No nosso caso, utilizámos o P341 F-GC e P518 R, que são primers universais bacterianos. 1 2 Legenda: Iniciador DNTP

Desnaturação de DNA a alta temperatura (95ºC); Descida de temperatura para os iniciadores se unirem à cadeia; Subida à temperatura optima de extensão da DNA polimerase; 1,2 e 3, constituem um ciclo que é repetido 35 vezes.

DGGE No final do PCR obtemos um único fragmento, mas que corresponde a uma enorme quantidade de DNA de diferentes microrganismos. Para os podermos separar usamos o DGGE Como funciona? Temos um gel com um gradiente de concentração de ureia, (maior concentração em baixo do gel.) A ureia vai desnaturar o DNA. Como temos diferentes sequencias de DNA, umas com mais G-C do que outros, estas vão oferecer maior resistência à desnaturação do que as ricas em A-T. As moléculas mais ricas em G-C migram mais, só desnaturando na zona do gel com mais ureia.

B – Material e métodos Micro pipetas Para pipetar pequenos volumes, as micro pipetas são um utensílio fundamental, que tivemos de aprender a utilizar correctamente.

Verificação do DNA Em 1 está colocado um gel de agarose, ligado a uma fonte de alimentação. No gel colocámos as amostras de DNA recolhido. O DNA migra do pólo negativo para o positivo, separando-se de acordo com o seu tamanho. Como vamos ver as bandas de DNA? Usamos Brometo de Etidio, que se intercala no DNA e é visível sob UV. 1

Corrida do gel

Para evitar contaminações as reacções de PCR são preparadas numa câmara previamente tratada com UV.

Após a preparação das soluções, fizemos o PCR no termociclador.

Preparação dos géis para o DGGE 3 1.Placa de agitação 2.Agitadores magnéticos 3.Gradientador: dois tubos que levam soluções com diferente concentração de ureia. 4. Bomba peristáltica. 2 4 1 Em 6 temos placas de vidro, onde é depositado o gel, que deriva do gradientador. 6

Tina de eletroforece Aqui é colocado o gel

C- Resultados Marcador; Amostra B (sem manganésio); Amostra M (com manganésio); 1 Por comparação com o marcador, podemos inferir que a amostra B tem menos concentração do que a amostra M. 2 3

Após o PCR vêm-se bandas da região amplificada, correspondente a um fragmento de cerca de 200 Pb. De novo, percebe-se que há mais concentração de amostra B do que de M.

Migração dos fragmentos em DGGE Com magnésio B Sem manganésio Marcador

D- Discussão É difícil visualizar as bandas da amostra B, muito provavelmente devido à quantidade de DNA presente. A banda assinalada na foto anterior não existe em B e poderá corresponder a um organismo que se adapta melhor a solos ricos em manganésio

Também se conclui que temos poucos microrganismos, ou seja, pouca diversidade; o gel ao lado é exemplo dos muitos microrganismos esperados em solos “saudáveis”