Bactérias, leveduras e algas: biofábricas de proteínas 3/25/2017 Graduação em Biotecnologia Disciplina de Biotecnologia Microbiana II Bactérias, leveduras e algas: biofábricas de proteínas Prof. Fabricio Rochedo Conceição fabricio.rochedo@ufpel.edu.br 27 de março de 2012 1

Por que produzir e purificar proteínas recombinantes? Estudos bioquímicos Determinação da estrutura 3D Aplicações biotecnológicas - Terapia - Vacinas - Diagnóstico... Alternativa para as seguintes limitações: Quantidade Dificuldade de purificação a partir do tecido original Contaminação (príons, vírus, oncogenes...) Estabilidade: proteínas recombinantes podem ser engenheiradas Processo completamente controlado Alguns microrganismos não são cultiváveis in vitro ou são fastidiosos

Pneumonia Micoplásmica Suína Mycoplasma hyopneumoniae Pneumonia Micoplásmica Suína

Como prevenir? Botulismo Toxóide Toxina botulínica Clostridium botulinum C e D Botulismo Toxina botulínica Como prevenir? Toxóide

Sistemas de expressão de proteínas heterólogas ***Algas, animais e plantas

2. Expression vectors 3. Hosts

Relação volume meio/capacidade do frasco 0,2 (20%) Inóculo – 5 a 10%

Bactérias e leveduras Produção industrial Microalgas

Algumas empresas que comercializam insumos para a expressão de proteínas heterólogas http://www.promega.com http://www.neb.com http://www.stratagene.com http://www.invitrogen.com

BACTÉRIAS Escherichia coli Bacillus subtilis Cultivo: - 28 a 37 C Aerobiose pH neutro Fonte de C e N, microelementos (sais)

APLICAÇÕES - Minimizar a proteólise Maximizar a expressão Minimizar “vazamento” de expressão (expressão de proteínas tóxicas) Facilitar o folding Solubilidade

Expressão heteróloga em E. coli Vantagens Desvantagens Genética e fisiologia bem conhecidas Não faz certas modificações pós-traducionais Enorme variedade de vetores disponíveis Atividade biológica pode diferir da proteína natural Fácil controle da expressão gênica A bactéria apresenta alto conteúdo de endotoxinas Facilidade de manutenção em laboratório Falta de um mecanismo de secreção Alta produção de proteínas heterólogas Formação de corpos de inclusão

*** Alternativas

Expressão heteróloga em B. subtilis Vantagens Desvantagens Não patogênico (sem LPS); GRAS Proteases extracelulares Codon usage adequado Plasmídeos instáveis Possibilidade de secreção da proteína Expressão geralmente menor que E. coli Biologia Molecular e Fisiologia conhecidas Alta produção de proteínas heterólogas *** Alternativas

Leveduras Eucariotos unicelulares – “organelas” Multiplicação rápida Manipulação simplificada Altas densidades celulares Não Patogênicas (GRAS) Fisiologia e genética bem conhecidas Realizam modificações pós-traducionais

Principais espécies utilizadas Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris Pichia methanolica Hansenula polymorpha (Pichia augusta) Kluyveromyces lactis Schizosaccharomyces pombe Schwanniomyces occidentalis Yarrowia lipolytica

Desvantagens Saccharomyces cerevisiae Hiperglicosilação – mais de 100 resíduos de manose Alteração da antigenicidade da proteína Alteração da estrutura 3D Produção de etanol – tóxico Falha na secreção de proteínas Alternativa: outras espécies de leveduras

Pichia pastoris Metilotrófica – metanol como fonte única de carbono Glicosilação mais estável e semelhante a de mamíferos Fermentação pobre – não produz etanol e atinge altas densidades celulares 28 a 30 C, aerobiose, pH 5,0 - 6,0 Fonte de C (glicerol, metanol...) Fonte de N (sulfato de amônio)

Pichia pastoris Desvantagens Proteólise de proteínas secretadas Poucos vetores disponíveis (Invitrogen) Necessita o uso de fermentadores para atingir alta densidade celular – no entanto não realiza fermentação. Precisa de oxigênio!

Metabolismo do Metanol Álcool Oxidase Dois genes: AOX1 e AOX2 AOX1 é mais expresso e altamente induzido na presença de metanol Enzima tem baixa afinidade por metanol, formando formaldeído. Compensa produzindo grande quantidade de AOX (~30% do total de prot)

Fenótipos Mut = Metanol Utilization Mut+ - crescimento rápido em metanol MutS – crescimento lento em metanol

Cepas

CLONAGEM - INTEGRAÇÃO

Proteínas expressas em Pichia

MICROALGAS Eucariotos unicelulares que realizam fotossíntese Elaboração de alimentos e obtenção de compostos naturais de valor agregado “Best of both worlds” Microrganismos: rápido crescimento e facilidade de cultivo Plantas: capacidade de realizar modificações pós-transcripcionais/traducionais Rápida produção e scale up Meio de cultivo muito barato: sais, CO2 e luz solar Não Patogênicas (GRAS) Baixo custo de produção de algumas proteínas recombinantes Chlamydomonas, Chlorella, Volvox, Haematococcus e Dunaliella Baixa expressão de proteínas heterólogas

Chlamydomonas reinhardtii

Cultivo: No geral 18 a 22 C Agitação Luz natural ou fluorescente pH 8,2 – 8,7 Microelementos (P, Zn, B...) Salinidade 20 a 24 g.L-1