VII CICI – Congresso de Iniciação Científica do IAMSPE IMUNOEXPRESSÃO DA PROTEÍNA GSK3β EM TECIDOS DE CARCINOMA COLORRETAL HUMANO PREPARADOS POR TISSUE MICROARRAY (TMA) VII CICI – Congresso de Iniciação Científica do IAMSPE Ac. Caio Dal Moro Alves Orientador: Prof. Dr. Jaques Waisberg

Introdução

Câncer colorretal (CCR): doença das mais prevalentes entre a população mundial. No Brasil  terceira neoplasia mais frequente no sexo masculino e a segunda no sexo feminino; (Instituto Nacional de Cancer – INCA. Estimativa 2012 incidência de câncer no Brasil: câncer do cólon e reto) A alta incidência de câncer no epitélio gastrintestinal como um todo está relacionada à rápida e contínua renovação celular deste tecido  sujeito a controle genético e exposto a toxinas dietéticas; (Leedham SJ, at al. From gene mutations to tumours--stem cells in gastrointestinal carcinogenesis. Cell Prolif. 2005; 38(6):387-405.)

Transição Epitelial-mesenquimal (TEM) Interrupção da homeostase celular  processo de malignização com comportamento agressivo  perda de características epiteliais e aquisição de fenótipo migratório Transição Epitelial-mesenquimal (TEM) TEM: evento crucial no processo de malignização Regulada por vias embriônicas como Wnt (Shih IM, et al. Top-down morphogenesis of colorectal tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001; 98(5):2640-5.) (Takayama T, et al. Analysis of K-ras, APC, and beta-catenin in aberrant crypt foci in sporadic adenoma, cancer, and familial adenomatous polyposis. Gastroenterology. 2001; 121(3):599-611. )

GSK3-β Teoria: 1- Fisiologicamente: atua como chave inibitória da via Wnt (Wnt/ β-catenina) por fosforilar a β-catenina marcando-a para degradação proteassomal (por Axina, CK-1, APC) 2- Patologicamente: ativação secundária a mutações  inativa processo desestabilizador da β-catenina  acumula no citoplasma celular  núcleo  transcrição de genes de proliferação celular (c-myc, ciclina D, VEGF)

GSK3-β Trabalhos: elevação de GSK3β é frequente em Neoplasias gastrointestinais 1- Gosh e Altieri, 2005, trabalhando com cultura de células de CCR concluíram que a ablação aguda do gene GSK3β, ativa o gene p-53 apoptose dependente e antagoniza o crescimento tumoral. Esses autores sugeriram que este achado poderia servir como base racional para o tratamento do CCR. 2- Shakaoori et al., 2009, mostraram que a inibição da proteína GSK3β pelo uso do dimetil sulfóxido (DMSO) atenuava a proliferação de células de CCR humano enxertadas em peritônio de ratos. 3- Mai et al., 2009, estudaram células de diversos tumores gastrintestinais e concluíram que, na maioria deles, a expressão da proteína GSK3β está aumentada em contraposição às células não neoplásicas. 4- Wang et al., 2009, compararam a expressão da proteína GSK3β em tumores de cólon de crescimento lateral e tumores de cólon do tipo protuso e sugeriram que a inativação da proteína GSK3β era mais claramente identificada no primeiro tipo.

Objetivo

Avaliar a imunoexpressão da proteína GSK3β no carcinoma colorretal e na mucosa adjacente não neoplásica, comparando estes resultados entre si.

Materiais e Métodos Estudo aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto de Assistência Médica ao Servidor Público Estadual de São Paulo (IAMSPE) (parecer no 043/09) e pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Escola Paulista de Medicina da Universidade Federal de São Paulo (EPM-UNIFESP) (parecer no 815/09) e obedeceu às normas da Declaração de Helsinki de 1964 e emendada em 1986.

Analisamos 64 doentes com CCR operados com intenção curativa ou paliativa no Serviço de Gastroenterologia Cirúrgica do Hospital do Servidor Público Estadual (HSPE) do IAMSPE – Setembro/2009 a Abril/2010 Critérios de Exclusão: menores de 18 anos de idade, doentes com CCR hereditário ou associado às doenças inflamatórias intestinais, enfermos submetidos à operação de urgência e deficiência do material histológico utilizado no estudo imuno-histoquímico. Divididos em grupos: 1) 54 pacientes (10 excluídos por insuficiência de material para imuno-histoquímica) cujas amostras foram obtidas do tumor 2) 54 pacientes (10 excluídos por insuficiência de material para imuno-histoquímica) cujas amostras foram obtidas do da mucosa colorretal adjacente não neoplásica.

Estudo Histológico Amostras fixadas em formalina 10% e processadas em parafina Lâminas coradas com hematoxilina-eosina(HE), para confirmação de diagnóstico Excluídos: áreas de necrose, hemorragia, desmoplasia e áreas com baixa celularidade ou acelulares

Construção do TMA O bloco de TMA foi elaborado usando aparelho de Beecher™ (Beecher Instruments, Silver Spring, MD, EUA) Etapas: 1- marcação da área selecionada no respectivo bloco de parafina; 2- construção da "casela" no bloco receptor; 3- extração de 1 mm de tecido do bloco doador da área de interesse previamente selecionada; 4- obtenção do tecido do cilindro de transferência a partir de bloco doador e sua colocação na "casela" anteriormente criada no bloco receptor; 5- progressão para as novas posições dentro do bloco receptor criando assim, um conjunto de amostras de tecido em matriz e avaliação da qualidade do bloco final para o armazenamento.

Fotografias do aparelho utilizado para a obtenção dos blocos de tissue microarray (TMA). Fonte: Laboratório de Patologia Molecular da UNIFESP/EPM

Cilindros de tissue microarray (TMA) corados com a técnica de hematoxilina-eosina. Fonte: Laboratório de Patologia Molecular UNIFESP/EPM

Estudo Imiuno-Histoquímico Lâminas pré-tratadas, desparafinizadas com xilol e etanol anticorpo primário: anticorpo de coelho policlonal primário anti-GSK3β (H-76), lote B1009 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) em concentração de 1:100 anticorpo secundário: biotinilado (LSAB-kit DakoCytomation, CA, USA)

Controle Positivo: utilizada lâmina contendo cortes histológicos de adenocarcinoma colorretal em tecido humano, comprovada como positiva para o anticorpo estudado. Controle Negativo: lâmina similar à positiva subtraindo o anticorpo primário da reação. Estudo da expressão imuno-histoquímica: método Hao et al. - positividade e intensidade da coloração acastanhada (reação positiva) - cálculo do escore final da imunoexpressão

Positividade: - grau 0: >5% células coradas Intensidade: - grau 0: negativa - grau 1: intensidade fraca - grau 2: intensidade moderada - grau 3: intensidade forte Escore final: variou de 0 a 12 (intensidade X positividade) - 0 a 8: reduzido - 9 a 12: forte

A(100X) B(400X) Fotomicrografias da imunoexpressão positiva do anticorpo GSK3β no citoplasma das células de carcinoma colorretal (imuno-histoquímica: A 100x; B 400x). Fonte: Laboratório de Patologia Molecular UNIFESP/EPM

Análise Estatística Correlação de Spearman: escores de imunoexpressão da proteína GSK3β Teste t Student: significância de parâmetros clinico-patológicos Testes do qui-quadrado e de Mann-Whitney: demais parâmetros Testes de qui-quadrado e Exato de Fischer: associação da positividade na marcação das proteínas Teste de McNemar: comparação da imunoexpressão da proteína GSK3β na mucosa adjacente não neoplásica e no carcinoma colorretal (dados pareados)  p=1,00 SPSS versão 15.0 (The Predictive Analytics Company, Chicago, IL, USA)

Resultados

Todas as amostras de carcinoma colorretal e de mucosa adjacente não neoplásica apresentaram percentagem de coloração acima de 50% positividade da imunoexpressão da proteína GSK3β na mucosa adjacente não neoplásica: forte em 81,5% das amostras positividade da imunoexpressão da proteína GSK3β no CCR: forte em mais de 80% das amostras

Intensidade N (%) Fraca 0 (0%) Moderada 10 (18,5%) Forte 44 (81,5%) Tabela 1 - Intensidade da imunoexpressão da proteína GSK3β na mucosa colorretal adjacente não neoplásica nos doentes com adenocarcinoma colorretal

Intensidade N (%) Fraca 1 (1,9%) Moderada 8 (14,8%) Forte 45 (83,3%) Tabela 2 - Intensidade da imunoexpressão da proteína GSK3β nos casos de adenocarcinoma colorretal.

Conclusão

Nas condições desse estudo, os resultados obtidos permitiram concluir que, de fato, a imunoexpressão da proteína GSK3β teve comportamento praticamente idêntico na mucosa adjacente não neoplásica e no CCR.

Obrigado