Treinamento Colunas Cromatográficas

Objetivo Padronizar a correta utilização, cuidados e acompanhamento da performance das colunas cromatográficas

Definição Compreende como a fase estacionária na cromatografia líquida. A fase estacionária é constituída ou por um sólido finamente dividido ou por um líquido impregnando um suporte sólido ou por um sólido modificado quimicamente por introdução de grupos orgânicos. A fase estacionária é responsável por reter o soluto devido sua adsorção, partição, troca iônica ou pela permeação em gel. Sendo os mais usados a separação por adsorção e por partição.

Recebimento das Colunas Verificação de acordo com a solicitação Codificação. Ex : DMA001 Arquivar o certificado de análise

Cuidados e manuseio das Colunas Evitar mudanças drásticas de fluxo e tipos de solventes; Utilizar sempre pré-coluna quando tiver; Filtrar e degaseificar a fase móvel; Não expor as colunas a temperaturas maiores que 60°C; Evitar colisões e quedas das colunas

Cuidados e manuseio das Colunas Não submeta a coluna a pH’s extremos se não for estritamente necessário; Nunca armazene ou estoque a coluna em soluções tamponadas; Utilize somente solventes grau HPLC;

Sequência de Limpeza para Colunas: C18/C8 e Fenil: tempo composição do solvente fluxo 0 a 15 minutos Água: metanol (90:10) 1mL/min 16 a 30 100% metanol 1 mL/min 31 a 45 100% acetonitrila 46 a 60 minutos água: acn (20:80)

Sequência de Limpeza para Coluna Si/CN: tempo composição do solvente fluxo 0 a 15 minutos Hexano 100% 1mL/min 16 a 30 isopropanol 100% 1 mL/min 31 a 45 eter 100% 46 a 60 minutos hexano 100%

Limpeza Água, Metanol ou Acetonitrila???? Qual proporção??? Qual a forma correta de lavar uma coluna RP após a utilização de uma fase móvel composta por tampão? Água, Metanol ou Acetonitrila???? Qual proporção??? Validade fase móvel???

Limpeza Ácida É feita com os mesmos parâmetros utilizados na limpeza de rotina, alterando somente os tipos de reagentes: Água – Metanol – Clorofórmio – Metanol – H2SO4 0,05M – ACN

Limpeza Ácida Quando é realizada? Quais os cuidados em relação aos reagentes utilizados?

Regeneração Colunas Antes de proceder à regeneração de uma coluna, certificar-se que somente com a limpeza não alcance o resultado esperado. Caso haja problema de pressão alta passar primeiramente água a 50°C, com vazão baixa pelo tempo que se julgar necessário. Se esses procedimentos não apresentarem bons resultados, proceder primeiramente com a sequência ácida, se não houver o resultado desejado, proceder com a regeneração específica para a coluna.

Regeneração Colunas Para a coluna de Si, não realizar a limpeza ácida, se for necessário proceder diretamente a regeneração específica; Toda regeneração deverá ser registrada no formulário de registro e acompanhamento da vida útil da coluna cromatográfica,conforme anexo I do procedimento.

Regeneração de Colunas Condições Gerais: Para regenerar uma coluna danificada (baixa seletividade, eficiência e simetria) proceder da seguinte forma: Colunas de 100, 125 e 150 x 4,0 e 4,6 mm: Condição de regeneração: 20 minutos por componente com vazão de 1 mL/min; Colunas de 250, 300 x 4,0 e 4,6 mm: Condição de regeneração: 40 minutos por componente com vazão de 1 mL/min.

Regeneração Colunas FASE REVERSA C8/C18 e Fenil: Água quente (50°C) – Metanol – ACN – THF – Etanol – Água –ACN FASE NORMAL CN: Heptano – Clorofórmio – Acetato de Etila – Acetona – Etanol – Água – ACN FASE NORMAL Si: Hexano – Cloreto de Metileno – Clorofórmio – Cloreto de Metileno – Hexano

Qualificação de Performance Processo empregado para verificação da eficiência da coluna cromatográfica, onde são analisados alguns parâmetros como assimetria, resolução, número de pratos teóricos, verificando dessa forma se a coluna atende aos requisitos farmacopéicos para análise.

Avaliação da Performance Colunas Seguir o procedimento de análise e as seguintes especificações: Assimetria: 0,8 a 1,8 Pratos teóricos: não menos que 2000. Desvio padrão relativo: não mais que 2,0%

Qualificação de Performance Quando os resultados obtidos em análise não estiverem dentro dos parâmetros estabelecidos para análise realizar uma investigação de todos os procedimentos analíticos para confirmação de problemas específicos da coluna.

Qualificação de Performance Caso haja necessidade de regeneração, proceder conforme procedimento de regeneração e logo após, realizar uma nova qualificação de performance para essa coluna e anexar os resultados na pasta de verificação de performance de colunas cromatográficas.

Qualificação de Performance Preencher o formulário de qualificação conforme o modelo juntamente com os cromatogramas de qualificação. Após a realização da qualificação deve ser preenchida uma etiqueta fixada na caixa da coluna cromatográfica.

Considerações Importantes Coluna é o coração do sistema, As três principais razões para falha em coluna reversa são: perda de fase ligada; Vazios na coluna; Contaminação coluna

Considerações Importantes  Quando uma coluna está ligada pela primeira vez, ou após ter sido armazenado por um longo tempo, ele precisa ser ativada. Nesta fase, recomenda-se que não deve ser conectada para o detector ainda, mas para deixar o solvente eluir fora livremente por 5 minutos para liberar partículas que pode ser liberado devido a problemas de embalagem, ou mesmo do ar.  

Considerações Importantes Perda de fase ligada: A medida que fase ligada é removida do suporte de sílica, tempos de retenção e resolução mudarão e picos dão mais cauda. Causa: Hidrólise siloxane da fase ligada ou reagentes. Prevenção: Opere com fase móvel de pH acima de 2 e temperatura menor que 60°C

Considerações Importantes Vazios na Coluna: Picos decrescem,alargam, eluem com cauda ou dividem. Causas: Colunas mal empacotadas, que se assentam durante o uso,dissolução de sílica por operação de pH elevado,aumento brusco da pressão, “colisões”.

Considerações Importantes Prevenção: Mantenha a pressão abaixo de 4000 psi e elimine grandes aumentos de pressão; Compre colunas de qualidade;

Considerações Importantes Contaminação na Coluna: Incrustações na coluna resulta material retido, isto pode conduzir a deslocamento da retenção do pico. Como por exemplo: materiais particulados ou amostras precipitadas e tampões. Causas: Impurezas na fase móvel, que adsorve na fase estacionária, é comum quando uma íon-par e outros aditivos;

Considerações importantes Prevenção: Limpe as amostras, antes da injeção, isto pode incluir filtração das amostras; Rotineiramente passe solvente forte através da coluna; Troque sempre frit

Considerações Importantes Eventualmente todas as colunas perdem o desempenho e devem ser substituídas. O tempo depende das condições cromatográficas usadas, bem como da própria coluna. Monitorando o desempenho da coluna pode-se saber se ela iniciou a se deteriorar e prever quando deve ser substituída.

Mensagem Final “Somos anjos de uma asa só e só podemos voar se abraçarmos uns aos outros”

Questões???????? cfonseca@lbaldacci.com.br