Genética Molecular em Análises Clinicas TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS Prof.Doutor José Cabeda

Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos PCR Real Time PCR NASBA/TMA

PCR

OPTIMIZAÇÃO DO PCR [MgCl2] Th [dNTP] [primers] [DNA] [inibidores]

Variações RT-PCR Multiplex PCR Nested PCR

Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos PCR Real Time PCR NASBA/TMA

Principio de funcionamento do Real-Time PCR 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda

Detecção dos produtos de PCR

Montar uma reacção

Prof.Doutor José Cabeda Químicas Utilizáveis 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda

SYBR-Green I Excitation 5’ 3’ SG SG SG SG SG

SYBR-Green I Excitation Emission SG SG 5’ 3’ SG SG SG

Detcção com SybGreen

Sybr-Green Detection Intercalates to dsDNA Inhibits DNA amplification so concentration is critical Detects specific and non-specific targets Low starting background with large increase in signal Can run a melt curve to look at product specificity

Detecção com sondas

Quimicas utilizáveis: sondas taqman

Sequence specific probes: Dual labeled probes 5’ 3’ Excitation Excitation 5’ 3’ Q R R R Q Q R Q

Quimicas utilizáveis: molecular beacons

Molecular Beacons I 10mer 25mer FAM DabCyl

Molecular Beacons II Emission R Q Excitation R Q Q R X

Molecular Beacons II Emission R Q Excitation R Q Q R X

Molecular Beacons III Can be used to quantitation and mutation detection Need beacons for the normal and mutation sequence Design is difficult due to nature of folding structure Expensive when compared to FRET

Quimicas utilizáveis: sondas FRET

Prof.Doutor José Cabeda Hyb-ProbesTM Emission Excitation Oligo 1: Fluorescein Oligo 2: Quencher Transfer 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda

Quenched FRET analysis 5’ 3’ Two labeled probes, FAM at the 5’ and BH1 on the 3’ When the probes hybridize the FAM energy is quenched by the BH1 After the product is amplified run a melt curve to determine genotype Different melt points are seen for normal and mutation

Quimicas utilizáveis: sondas Eclipse F Q MGB Q F

Prof.Doutor José Cabeda Aplicações Quantificação 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda

End Point versus Real-Time

Quantificação

Detecção de Mutações / SNP Aplicações Detecção de Mutações / SNP 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda

Detecção de mutações

Prof.Doutor José Cabeda Aplicações Multiplex Detection 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda

Detecção simultânea de vários produtos

Prof.Doutor José Cabeda Os equipamentos 2001/2002 Prof.Doutor José Cabeda

Light Cycler

Smartcycler

Rotorgene The samples spin continually during a run at 500 rpm The samples are heated and cooled in a low mass air oven Tubes are illuminated as they pass the detector On data acquisition energy is averaged over 20 revolutions to give the fluorescence of each sample Four Channels Ch1: ex 470nm, det 510nm Ch2: ex 530nm, det 550nm Ch3: ex 585nm, det 610nm Ch4: ex 625nm, det 660nm

O Futuro próximo

Detecção com sondas

Detcção com SybGreen

Quantificação

Detecção de mutações

Detecção simultânea de dois produtos

Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos PCR Real Time PCR NASBA/TMA

NASBA/ NUCLISENS

Amplification: schematic diagram Primer 1 Legend: sense RNA antisense RNA sense DNA antisense DNA Reverse Transcriptase RNase H Primer 2 Reverse Transcriptase T7 RNA polymerase Primer 2 Reverse Transcriptase Reverse Transcriptase RNase H Primer 1

Técnicas de amplificação de Sinal bDNA (Quantiplex)

bDNA (I)

bDNA (II)

bDNA (III)

bDNA (IV)

bDNA (V)