Técnicas de Biologia Molecular:

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1 Técnicas de Biologia Molecular:
Centro de Ciências Exatas e da Natureza Departamento de Biologia Molecular Disciplina: Genética Molecular Técnicas de Biologia Molecular: PCR e PCR Real Time Prof. Eleonidas Moura Lima

2 Reação em Cadeia da Polimerase - PCR
Kary Mullis 1987 Texto xerox Thermus aquaticus

3 Termocicladores Texto xerox

4 Qual é dinâmica da PCR? Texto xerox

5 Qual a finalidade do uso da PCR?
PCR - consiste em fazer cópias de DNA “in vitro”, usando os elementos básicos do processo de replicação natural do DNA. Texto xerox

6 Quais os componentes da PCR?
Taq DNA Polimerase dNTPs: dATP, dGTP, dCTP e dTTP DNA molde Primers Tampão MgCl2 Texto xerox

7 Quais os componentes da PCR?
Taq DNA Polimerase dNTPs: dATP, dGTP, dCTP e dTTP DNA molde Primers Tampão MgCl2 Texto xerox

8 Quais os componentes da PCR?
Taq DNA Polimerase dNTPs: dATP, dGTP, dCTP e dTTP DNA molde Primers Tampão MgCl2 Texto xerox

9 Quais os componentes da PCR?
Taq DNA Polimerase dNTPs: dATP, dGTP, dCTP e dTTP DNA molde Primers Tampão MgCl2 Texto xerox

10 Quais os componentes da PCR?
Taq DNA Polimerase dNTPs: dATP, dGTP, dCTP e dTTP DNA molde Primers Tampão MgCl2 Texto xerox

11 Quais os componentes da PCR?
Taq DNA Polimerase dNTPs: dATP, dGTP, dCTP e dTTP DNA molde Primers Tampão MgCl2 Texto xerox

12 Como analisar o produto da PCR?
Texto xerox

13 Eletroforese Texto xerox

14 Gel de Agarose Agarose diluída em tampão
Deixar a agarose solidificar em um suporte que acompanha a cuba Texto xerox Aplicação das amostras (produtos de PCR) no gel polimerizado de agarose

15 Visualização em Gel de Agarose
Texto xerox

16 Gel de Poliacrilamida Texto xerox Gel de Poliacrilamida PCR-SSCP

17 2°- Passo: Desenhar e avaliar os iniciadores ou primers
Validação in sílico Exemplo: Triagem de mutações no gene TP53 ( exon 2) e sua associação à evolução do câncer gástrico . 1º- Passo: Obter a sequência de interesse do gene para desenhar os iniciadores ou primers 2°- Passo: Desenhar e avaliar os iniciadores ou primers Texto xerox 3°- Passo: Avaliar o especificação do iniciadores ou primers através da comparação com genoma (BLAST)

18 Obtenção de Sequência de interesse
As sequências de interesse são obtidas nos bancos de dados que são públicos Texto xerox Validação in sílico

19 Obtenção de Sequência de interesse
Texto xerox Validação in sílico

20 Obtenção de Sequência de interesse
Texto xerox Validação in sílico

21 Obtenção de Sequência de interesse
Texto xerox

22 Obtenção de Sequência de interesse
Texto xerox

23 Desenho e Avaliação dos Primers ou Iniciadores
Algumas características importantes: Tamanho do primers A temperatura de anelamento Evitar estruturas secundárias Avaliação da ΔG do sistema e na extremidade 3’ Texto xerox Validação in sílico

24 Desenho e Avaliação dos Primers ou Iniciadores
Algumas características importantes: Tamanho do primers A temperatura de anelamento Evitar estruturas secundárias Avaliação da ΔG do sistema e na extremidade 3’ Texto xerox Validação in sílico

25 Desenho e Avaliação dos Primers ou Iniciadores
Algumas características importantes: Tamanho do primers A temperatura de anelamento Evitar estruturas secundárias Avaliação da ΔG do sistema e na extremidade 3’ Texto xerox Validação in sílico

26 Desenho e Avaliação dos Primers ou Iniciadores
Algumas características importantes: Tamanho do primers A temperatura de anelamento Evitar estruturas secundárias Avaliação da ΔG do sistema e na extremidade 3’ Texto xerox Validação in sílico

27 Validação in sílico Programa Texto xerox Validação in sílico

28 Validação in sílico para Metilação
Texto xerox Validação in sílico

29 PAGE (Acrilamida : Bis - 49:1) Gel de 5%a 6%
SSCP-PCR PAGE (Acrilamida : Bis - 49:1) Gel de 5%a 6% 5% Glicerol - agente desnaturante fraco - detecta mutações raras Temperatura: C Eletroforese: 10-20W (12-16 h) Detecção: Prata Eficiência: < 200 pb (100%) Texto xerox

30 SSCP-PCR Eletroforese em gel poliacrilamida Texto xerox

31 Gel SSCP Texto xerox Análise de gel

32 MSP - Metilação PCR específica
Texto xerox Análise de gel

33 RAPD – PCR randômico Texto xerox Análise de gel

34 Nestd-PCR – PCR de alta especificidade
Texto xerox Análise de gel

35 Microssatelite PCR Texto xerox Análise de gel

36 PCR – Tempo Real Sistemas

37 Curva de Calibração Número de ciclos Fluorescência Texto xerox

38 PCR – Tempo Real (SYBR GREEN)

39 PCR – Tempo Real (SYBR GREEN)

40 PCR – Tempo Real GAPDH MYCC MYCN

41 PCR – Tempo Real GAPDH MYCC MYCN

42 PCR – Tempo Real GAPDH MYCC MYCN

43 PCR – Tempo Real GAPDH GAPDH MYCC MYCN

44 PCR – Tempo Real GAPDH MYCC GAPDH MYCC MYCN

45 PCR – Tempo Real GAPDH MYCC MYCN GAPDH MYCC MYCN

46 PCR – Tempo Real GAPDH MYCC MYCN GAPDH MYCC MYCN

47 PCR – Tempo Real GAPDH MYCC MYCN GAPDH MYCC MYCN

48 PCR – Tempo Real GAPDH MYCC MYCN GAPDH MYCC MYCN

49 PCR – Tempo Real GAPDH MYCC MYCN GAPDH MYCC MYCN

50 PCR – Tempo Real (TaqMan)
Quencher Reporter Q R Texto xerox

51 TaqMan-5’ Nuclease PCR Polymerization Strand displacement Cleavage
Probe Polymerization Strand displacement Cleavage Polymerization completed Reporter Quencher Texto xerox

52 PCR – Tempo Real (TaqMan)
Texto xerox

53 PCR – Tempo Real (TaqMan)
Texto xerox

54 PCR – Tempo Real (TaqMan)
Texto xerox

55 PCR – Tempo Real (TaqMan)
Ct 23 Ct 33 Ct: Número do ciclo no qual o número de cópias fica acima do limiar de detecção (início da fase geométrica). Texto xerox

56 Aplicações da PCR- Real Time
DIAGNÓSTICOS DIVERSOS: Análise de expressão gênica; Carga Viral; Monitoramento Doença Residual Mínima; Análise de SNP; Etc...

57 Técnicas de Biologia Molecular:
Centro de Ciências Exatas e da Natureza Departamento de Biologia Molecular Disciplina: Genética Molecular Técnicas de Biologia Molecular: PCR e PCR Real Time Prof. Eleonidas Moura Lima