UBAIII Biologia Molecular 1º Ano 2012/2013

Sumário: D. Técnicas de Biologia Molecular em Ciências da Saúde Capítulo XIV. Técnicas básicas para o estudo de ácidos nucleicos. Isolamento e purificação de ácidos nucleicos Separação de ácidos nucleicos Visualização Tecnologia de DNA recombinante Capítulo XV. Biotecnologia Aplicada às Ciências da Saúde Microarrays princípios da técnica O que são microarrays? Vários tipos de sondas (DNA, cDNA, RNA, proteínas) Hibridização Leitura Aplicações dos microarrays em medicina: Expressão diferencial de genes Biomarcadores Marcadores de alvos clinicos, funções biológicas semelhantes, ligação entre genes Detecção de agentes patogénicos MJC-T14 17Jan/2013

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Purificação dos ácidos nucleicos Homogeneização das células Lise nuclear com solução tamponada de NaCl com SDS. Precipitação proteica com fenol/clorofórmio Centrifugação Adição de etanol  precipitação dos ácidos nucleicos Separação das proteínas e RNA MJC-T14 17Jan/2013

Obtido o DNA em filamentos brancos É novamente dissolvido em solução aquosa Tratado com RNAse Pode ser também obtido RNA se o tratamento for feito com DNAse RNAse ou DNAse removidas com protease Lavagem com fenol (para remover .....) Precipitação com etanol. MJC-T14 17Jan/2013

Mais recentemente.... Colunas para isolamento de DNA Membranas e matrizes que ligam DNA especificamente Lisado de células + matriz  lavado e centrifugado  Eluição da matriz. http://www1.qiagen.com/jump/QIAampKits/QIAampKitsReferences.aspx MJC-T14 17Jan/2013

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Separação do DNA Tamanho Composição de bases Electroforese Topologia Sequência de nucleótidos Electroforese Ultracentrifugação MJC-T14 17Jan/2013

Electroforese http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/ MJC-T14 17Jan/2013

Ultracentrifugação – Velocidade de sedimentação Unidades S  influência da massa. MJC-T14 17Jan/2013

Ultracentrifugação – Centrifugação equilibrada Separa também moléculas com radioisótopos. MJC-T14 17Jan/2013

Hibridização de ácidos nucleicos MJC-T14 17Jan/2013

Hibridização de ácidos nucleicos MJC-T14 17Jan/2013

Tecnologia do DNA recombinante – enzimas de restrição MJC-T14 17Jan/2013

Formação do DNA recombinante MJC-T14 17Jan/2013

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Clonagem do DNA em bactérias MJC-T14 17Jan/2013

Clonagem do DNA em bactérias MJC-T14 17Jan/2013

Clonagem do DNA em bactérias MJC-T14 17Jan/2013

Clonagem do DNA em bactérias MJC-T14 17Jan/2013

Clonagem do DNA em bactérias-screening MJC-T14 17Jan/2013

Clonagem do DNA em bactérias-screening MJC-T14 17Jan/2013

Separação dos Plasmideos por centrifugação Corte com as enzimas de restrição iniciais MJC-T14 17Jan/2013

Clonagem do DNA em vírus MJC-T14 17Jan/2013

Clonagem do DNA em vírus MJC-T14 17Jan/2013

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O que significa Microarray? High throughput MJC-T14 17Jan/2013

O que é posto nas lâminas? Sondas (?) Moléculas com capacidade de se ligar a outras  hibridizar DNA cu RNA Proteínas Qual a origem deste material? Bibliotecas de DNA Genómicas cDNA DNA Com que hibridizam? MJC-T14 17Jan/2013

Escolha das sondas a utilizar Comprimento 20-100 bases Especificidade Impressão da lâmina Orientação do fragmento Hibridização pretendida As sondas hibridizam com a amostra que é marcada com fluorescência. Assim um sinal fluorescente no resultado o que significa? MJC-T14 17Jan/2013

Condições de hibridização Quantidade e qualidade da amostra Replicação com [amostra] Solução de hibridização e lavagem Normalmente é definida pelo fabricante do chip Tempo de incubação Gerido em função de estudos piloto e também definido pelo fabricante Temperatura de incubação Depende por vezes da sequência (conteudo GC)  Porquê? MJC-T14 17Jan/2013

Leitura do chip Depende de ter sido utilizado 1 ou 2 corantes diferentes MJC-T14 17Jan/2013

Expressão diferencial de genes MJC-T14 17Jan/2013

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Recursos utilizados Capítulo 18 Karp secções 18.9-18.11. e secção 18.13. Capítulo 12 Karp secção 12.4 http://www.bio.davidson.edu/Courses/genomics/chip/chip. html (Microarray de DNA de leveduras). MJC-T14 17Jan/2013