Validação de Métodos e Instrumentos em Análise Química 6 de Novembro de 2006

Considerações Gerais sobre Validação/Qualificação (1de2) É indispensável que os trabalhos executados num laboratório mereçam confiança. Sendo qualquer actividade humana susceptível de erros, devem ser tomadas precauções para diminuir as probabilidades de que ocorram erros. Admitir-se-á que o laboratório deverá dispor de meios humanos que, além de serem em número suficiente são devidamente competentes e qualificados. Iremos discutir: Instrumentos de medida usados em ensaios. Sistemas de aquisição e tratamento de dados. Métodos de ensaio.

Considerações Gerais sobre Validação/Qualificação (2de2) Num laboratório, tem que se assegurar que os meios materiais e humanos são adequados para a realização dos ensaios (em qualificação e número). Para efeito de exposição destes assuntos serão tratados em separado os vários componentes do Laboratório: nesta aula vamos admitir que os equipamentos do laboratório e os respectivos operadores estão qualificados para a realização dos ensaios e começaremos por apresentar e discutir a validação de métodos de análise química.

Validação de Métodos de Ensaio A Validação dum Método de Ensaio (de Análise) é o procedimento utilizado para provar que esse método de análise é suficientemente rigoroso para dar resultados dignos de confiança para o fim em vista. Para isso, há que verificar a conformidade do método com vários critérios para o que terá que se proceder a ensaios de forma ajustada à natureza do método e das amostras a analisar.

Delineamento Experimental para Ensaios de Validação Antes de começar o trabalho experimental há que ter em conta a natureza das técnicas utilizadas bem como o trabalho já realizado no desenvolvimento do método de ensaio. Vai tomar-se como exemplo um tipo de método para análise química. Para enquadrar a discussão deste assunto vai então admitir-se que se usa uma técnica cromatográfica e em que não é necessário ter preocupações com pormenores relativos às fases de amostragem, conservação de amostras e pré-tratamento das amostras a ensaiar.

Critérios de Validação e Adequabilidade do Método Vamos avaliar o método de análise química utilizando vários critérios mas no fim terá que ser feita uma avaliação global do método para verificar se é adequado para os fins em vista. Na realidade, um método de análise pode servir para analisar um componente duma amostra e ser inadequado para analisar outro tipo de amostra: pode considerar-se como exemplo um método de análise de ferro num minério em que o teor pode ser da ordem de 70% e, por outro lado, a análise de ferro numa água natural em que a concentração de ferro pode ser da ordem de 70ppm.

Selectividade/Especificidade (Interferências) Possibilidade do método fazer discriminação entre o composto que está a ser analisado e outros componentes (interferentes) eventualmente existentes na amostra a analisar. No caso de técnicas cromatográficas, esta verificação pode ser sistematizada em termos de: Factor de capacidade do componente a analisar Número de pratos teóricos da coluna cromatográfica Factores de separação Factores de resolução Assimetria do pico cromatográfico.

Linearidade (1de2) Como sugestão, ensaiar soluções de padrão em diferentes concentrações situadas (por exemplo) na gama de 10 a 150% da concentração que se prevê existir nas amostras. Verificar se existe uma relação linear entre os valores medidos e as concentrações: Observar o aspecto da curva de calibração. Cálculo de regressão linear. Prestar atenção aos resíduos (em valores relativos) e verificar se os desvios em relação à recta de mínimos quadrados são superiores a 5%.

Linearidade (2de2) Relativamente a este tratamento pode discutir-se: Inclusão ou não da origem nos pontos experimentais. No caso de haver indícios de desvios de linearidade, experimentar ajustamentos não lineares pelo método de mínimos quadrados e testar os resultados por critério estatístico (existem normas como, por exemplo, ISO Standards Compendium, First Edition, Geneva, 1994). Muitas vezes, opta-se por estabelecer a gama de de trabalho em zona de linearidade e diluir amostras se for necessário.

Medição da Amplitude do Ruído Para calcular o limite de detecção interessa medir o valor da amplitude de ruído de período curto para o que há vários métodos como traçar só duas rectas paralelas ou considerar segmentos e fazer a média dos ruídos medidos para os segmentos. Em alternativa a este método “pico a pico”, pode usar-se método de cálculo RMS (Root Mean Square) que também existe em muitos sistemas de dados.

Limites de Detecção e de Quantificação. Sensibilidade do Método Limite de detecção corresponde à concentração mínima que é detectável nas condições do ensaio: Pode considerar-se igual à concentração correspondente a 2 ou 3 vezes o ruído de período curto. Limite de quantificação corresponde à concentração mínima que é quantificável nas condições do ensaio: Pode considerar-se igual à concentração correspondente a 10 vezes o ruído de período curto. Sensibilidade do método: declive da recta de calibração.

Precisão (1de2) A precisão corresponde a uma medida da concordância entre os valores obtidos por aplicação do método em análises (repetidas) para mesma amostra. Nos ensaios para estudar a precisão há várias etapas e começa-se por avaliar a Repetibilidade: resultados obtidos em sequência de análises realizadas para a mesma amostra no mesmo dia pelo mesmo operador com os mesmos reagentes e no mesmo equipamento. Se os resultados forem considerados satisfatórios, passa-se para o estudo da precisão intermédia.

Precisão (2de2) Para avaliar a precisão intermédia faz-se um estudo intra-laboratorial (no mesmo laboratório) em que análises da mesma amostra vão ser realizadas em dias diferentes por diferentes operadores, com reagentes de origem diferente e, eventualmente, com equipamentos diferentes. Finalmente a precisão do método terá de ser avaliada mediante ensaios inter-laboratoriais organizados por instituições dignas de confiança e em que se parte de uma quantidade suficientemente grande de amostra que é enviada a diferentes laboratórios onde vai ser analisada pelos métodos usados nesses laboratórios. No fim, é feita uma análise estatística do conjunto de resultados que é dada a conhecer aos participantes mas mantendo confidencial a identidade dos participantes.

Exactidão (1de2) A exactidão vai corresponder a uma medida da concordância entre o valor obtido por aplicação do método de análise e o “valor verdadeiro”. Modos de proceder: São muito usados os ensaios de fortificação de amostras. Parte-se de uma amostra que não contém o composto que se pretende dosear e adiciona-se à amostra uma quantidade conhecida desse composto pelo que se fica a conhecer a respectiva concentração. Aplica-se o método de análise e compara-se o valor medido com o valor teórico. Geralmente o valor é expresso na forma de percentagem de recuperação.

Exactidão (2de2) No caso de existir um método de referência, a mesma amostra é analisada pelos dois métodos e os resultados são comparados. Havendo material de referência certificado (ou equivalente), pode analisar-se esse material pelo método que está a ser estudado e comparar o resultado obtido com o valor que consta do certificado. A participação em ensaios de intercalibração também permite avaliar a exactidão pois quando se recebe o relatório final fica-se a conhecer um valor credível para a concentração na amostra analisada.

Robustez A robustez do método é uma medida da influência que pequenas variações de condições experimentais podem ter nos resultados. Para avaliar a influência de variações nos vários parâmetros, pode testar-se um a um ou então variar simultaneamente vários mas de acordo com programação cuidadosa dos ensaios. Para uso de amostradores automáticos deve ter-se em conta a estabilidade das soluções: 16 ou 64 horas.

Conformidade com Normas Internacionais de Validação Existem normas de validação de método bem como guias para interpretação de resultados dos ensaios de validação de que são exemplos: USP - United States Pharmacopeia ICH – International Conference on Harmonization. Os trabalhos de validação de métodos já se encontram facilitados por software de sistemas cromatográficos: executam automaticamente tarefas usando valores previamente especificados para os parâmetros e verificam se valores calculados estão em conformidade com os requisitos, produzem documento (relatório) e fazem registo electrónico dos resultados.

Considerações Finais sobre Validação de Método Validação de Métodos de Ensaio (Cromatografia) Considerações Finais sobre Validação de Método Pode aligeirar-se este trabalho de validação de métodos de análise se os métodos a adoptar no laboratório forem normalizados ou aceites por instituições dignas de confiança. Outra observação a fazer é que se torna necessário revalidar um método de ensaio se vão ser feitas alterações significativas no método. Como conclusão final, pode afirmar-se que não vale a pena fazer análises de rotina com método que não esteja validado. 15 de Dezembro de 2003