Universidade Federal de Viçosa BIO 796 – Problemas Especiais III - Bioinformática Genômica funcional como instrumento para estudo da resistência do cafeeiro a ferrugem Samuel Mazzinghy Alvarenga

Problema: Ferrugem: Doença causada pelo fungo Hemileia vastatrix que acarreta muitos prejuízos para a cafeicultura. Objetivo do trabalho: Identificar seqüências do Projeto Genoma Café que estejam ligados à resistência do cafeeiro a ferrugem Desenvolver marcadores de DNA a partir das seqüências identificadas, para que sejam usados no auxílio aos programas de melhoramento genético visando resistência Analisar as seqüências identificadas visando fornecer informações sobre o mecanismo de resistência do cafeeiro a ferrugem Gerar CONHECIMENTO para o desenvolvimento de estratégias eficientes de controle dessa doença

Projeto Genoma Café - Bibliotecas Tecidos submetidos a diversos tipos de estresses (ou não) Extração de RNA Construção de bibliotecas de cDNA

Seqüências de DNA (ESTs raw reads) Montagem dos contigs Sequenciamento Trimagem http://www.lge.ibi.unicamp.br/cafe/ Base de dados

Mineração de dados Estratégias Recursos Coleta de seqüências em bancos específicos Bancos de dados mencionados nas literaturas http://www.sgn.cornell.edu/ Pesquisa em bancos de dados públicos Entrez Gene http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene Análise de expressão diferencial Digital Differential Display http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/ddd.cgi?ORG=Les Biblioteca subtrativa Plataformas específicas de análises Northern Eletrônico http://www.lge.ibi.unicamp.br/cafe/ Outras Vai depender do seu trabalho !

Coleta de seqüências em bancos específicos Mineração de dados Coleta de seqüências em bancos específicos

Coleta de seqüências em bancos específicos Mineração de dados Coleta de seqüências em bancos específicos

Pesquisa em bancos de dados públicos Mineração de dados Pesquisa em bancos de dados públicos

Pesquisa em bancos de dados públicos Mineração de dados Pesquisa em bancos de dados públicos

Pesquisa em bancos de dados públicos Mineração de dados Pesquisa em bancos de dados públicos Análise de seqüência por seqüência, selecionando aquelas que julgar promissoras

Pesquisa em bancos de dados públicos Mineração de dados Pesquisa em bancos de dados públicos

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Análise de expressão diferencial Mineração de dados Análise de expressão diferencial

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Mineração de dados Biblioteca Subtrativa Biblioteca de folhas infectadas Biblioteca A Biblioteca B Biblioteca C Biblioteca D ESTs presentes somente nesta biblioteca

Mineração de dados Northern Eletrônico

Mineração de dados Northern Eletrônico

Mineração de dados Outros....

Mineração de dados Outros....

Mineração de dados Outros....

Mineração de dados Outros.... Escolha das seqüências de interesse e armazenamento em projetos organizados por palavras-chave

NCBI, Pfam, Trembl, Prosite Phred Atribui valores de qualidade às bases Seqüênciamento Consed Visualiza e edita arquivos gerados pelo Phred Trimagem Retirada de “contaminações” Cálculo de sobreposição de reads Montagem Cap3, Crossmatch Remoção de falsas sobreposições Construção dos contigs Anotação NCBI, Pfam, Trembl, Prosite Bancos de dados ORF Finder Encontra fases de leitura BLAST Busca por similaridades KEGG Inferência de rotas metabólicas GO Inferência de funções moleculares, processos biológicos e localização celular Mineração de dados Escolha e análise das seqüências de interesse para o seu trabalho A partir daqui, cada um segue o seu caminho...

No caso de obtenção de marcadores moleculares Mineração de dados Escolha das seqüências candidatas Desenho de primers específicos Teste de estabilidade dos primers Ajuste de protocolo de amplificação Testes de Amplificação com indivíduos resistentes e susceptíveis da população Obtenção das marcas moleculares

Desenho dos primers http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

Desenho dos primers

Desenho dos primers

Obtenção de marcas moleculares Perfil de amplificação do primer CARF 005 Indivíduos susceptíveis (1-12) Indivíduos resistentes (13-24) M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Próximas etapas Analisar as seqüências obtidas pelos primers polimórficos Fazer estudo de expressão nas seqüências cujos primers não mostraram polimorfismo RT-PCR Macroarranjo Disponibilizar o conhecimento obtido para a comunidade científica