Animais Transgênicos e Células-Tronco Guilherme Pereira Isabela Ascencio Rafael Della Coletta Raquel Peron Suzane Saito

Introdução Animal Transgênico “Um animal que possui seu genoma modificado artificialmente pelo homem, quer por meio da introdução, quer da alteração ou da inativação de um gene. Esse processo deve culminar na alteração da informação genética contida em todas as células desse animal, até mesmo nas células germinativas, fazendo com que essa modificação seja transmitida aos descendentes” (Federação Européia das Associações de Ciência em Animais de Laboratório)

Tópicos Abordados Como são “produzidos” estes animais? Cultivo de células, processos de transfecção e geração do animal Aonde e para quê são utilizados? Outros exemplos Algumas considerações

Cultivo in vitro de Células Animais

Cultivo de Células Animais Cultura de células animais  pequenas quantidades tecidos específicos Colocados meio de cultura com proteases para quebrar ligação entre células Trocada de meio e adição Fetal Bovine Serum - Soro Fetal Bovino (suplementação nutricional da célula-tronco e células iPS) Dois tipos de linhagens celulares: Células mortais Células imortais *Cultura de cel animais = pequenas quantidades tecidos especficos *Colocados meio de cultura com proteases para quebrar ligação entre cel *Trocada de meio e add Fetal Bovine Serum - Soro Fetal Bovino (suplementação nutricional da célula-tronco e células iPS) *2 tipos linhagens cel: 1 cel mortais 2 cel imortais *Cel imortais obtidas infecção viral ou mudanças que desrregulem divisão cel e crescimento

Processos de Transfecção

Definições Transfecção= inserção DNA exógeno dentro célula animal 2 estágios: 1= inserção dentro célula 2= integração ao genoma Transfecção transitória: modo rápido de analise de genes exógenos e seus produtos uma vez que a célula degrada o DNA inserido durante divisão celular Transfecção estável: DNA exógeno é integrado genoma do hospedeiro e é replicado junto com o cromossomo do mesmo e a expressão do gene pode ou não ocorrer Inserção DNA célula mais eficiente que esse no genoma

Transfecção Química DNA exógeno precipitado pelo CaCl2 e incorporado via endocitose Eficiência 1-2% método onde cel são lavadas com tampão de fosfatase e depois é add DNA exog e cloreto de calcio a mistura ( DNA é precipitado e é incorporado por endocitose) eficiencia 1-2%

Transfecção Mediada Lipossomo Esferas de lipídios catiônicos são usadas para encapsular DNA : lipossomos ( esfera de lipidio) catiônicos positivos são usados para encapsular DNA > lipossomo carregado se liga a membrana plasm e transf o DNA diretamente através da mesma. Tem maior capacidade de escapar dos endossomos Lipossomo carregado se liga a membrana plasmática e ocorre transferência DNA

Transfecção Peptídeos: algumas sequências de peptídeos podem ser ligar ao DNA e promover transfecção por endocitose Direta: através de plasmídio com gene de interesse inserido diretamente no núcleo  baixa eficiência quando comparado a por lipossomos SV40: vírus dupla fita encontrado em primatas que infecta células dos rins e células mamarias variadas  limitado pelo tamanho DNA exógeno 2300 bp Eletroporação: desestabilização membrana plasmática por exposição a campo elétrico

Transfecção Adenovírus Vetor com capacidade transferir 7 Kbp de DNA exógeno Expressão transiente de genes Adenovírus: (vírus gripe) vetor com maior capacidade de transferir DNA exógeno 7Kbp usado para produzir proteinas exógenas em diferentes tipos celulares expressão dos genes transientes por ele n incorporar o gene no genoma do hospedeiro usado tratamento com terapia genica Utilizado terapia gênica

Transfecção Adeno-Associated Virus (AAV) Vírus não descrito associado família parvovírus DNA fita simples; naturalmente deficiente na replicação Requer a presença de outro vírus para completar seu ciclo; inseri DNA no cromossomo 19 apenas Adeno-associated Virus (AAV): não descrito virus mas associado familia parvovirus, possui DNA fita simples 5000 bp, naturalmente deficiente na replicação, requer outro virus para completar ciclo; integra DNA exog ao hospedeiro no cromossomo 19 humanos, grande habilidade de infectar vários tipos celulares Habilidade infectar vários tipos celulares

Transfecção Retrovírus 2 fitas simples de RNA parecidas com mRNA; utiliza transcriptase reversa Infecção por ligação específica do envelope viral com receptores da membrana do hospedeiro Desvantagens: efeitos deletérios classe HTLV requer células em processo divisão para que ocorra infecção classe HIV não requer células em divisão, mas sua utilização como vetor não é segura Retrovírus : possui 2 fitas simples idênticas de RNA parecidas com mRNA, utiliza transcriptase reversa , infecção por ligação do envelope com receptores específicos da membrana hospedeiro, maior vantagem estabilidade inserção do gene interesse no hospedeiro, desvantagens: inserção ao acaso pode causar efeitos deletérios, classe HTLV desses vírus requer células em divisão para infecção, classe HIV vírus não requer células em processo divisão, utilização desse tipo de vetor ainda não é segura.

Marcadores Seleção e Amplificação de Genes Marcadores mais utilizados são os que conferem resistência a drogas: antibióticos entre outros Genes de resistência a drogas são inseridos juntamente com o gene de interesse e expressos no genoma do hospedeiro Com o passar das gerações pode ocorrer amplificação da resistência Genes de resistencia as drogas são inseridos e expressos e podem ocasionar até aumento da resistencia com maior expressão ao longo do tempo

Expressão Genes em Células Animais Expressão está intimamente ligada aos elementos de controle de transcrição e tradução Muitos promotores que regulam expressão em animais são constitutivos Alguns fortes promotores constitutivos são: adenovírus MPL, SV40, Rous sarcoma vírus etc.

Como Gerar um Animal Transgênico?

Principais Métodos Injeção Pronuclear Células Tronco Embrionárias Transferência Nuclear

Injeção Pronuclear Pronúcleo masculino – Maior Pronúcleo feminino – Menor Transfecção direta do DNA Antes da fusão dos pronúcleos in vitro – Mórula Filhotes heterozigotos Cruzamento para homozigose

Injeção Pronuclear Vantagem Desvantagem Não precisa de vetor Não pode ser utilizado para knockout Inserção aleatória Afeta expressão Mosaico Transgene integra depois da primeira divisão celular Múltiplas inserções Ex: Proteína AAT (inibe elastase), impede a destruição de tecido que ocorre na fibrose cística. Colocaram um promotor de produção de leite de camundongo antes do gene que expressa AAT. -> Secretaram a proteína no leite. Fizeram o mesmo em ovelhas, aumentando a produção.

Células Tronco Embrionárias Células internas de blastocistos in vitro – células separadas Transfecção com plasmídeo Introdução em novos blastocistos Quimeras Cruzamento com não-transgênico – heterozigoto Cruzamento entre heterozigotos

Células Tronco Embrionárias Vantagens Eficiência na recombinação homóloga Knockout e alterações em genes Desvantagens Ocorrem recombinações não-homólogas

Knockout 3 classes geradas Letal Fenótipo não-observável Analisada em heterozigose Fenótipo não-observável Genes compensando a função Técnica pouco desenvolvida Fenótipo observável Conferir background da linhagem Tempo e custo

Knockout Sítios de loxP + Cre recombinase Transfecção com plasmídeo Cre com promotor induzível Interferon - presença Tetraciclina - ausência Gene marcador de resistência Indesejados no animal Usado em fenótipos letais Gene flanqueado por loxP Knockout após nascimento

Transferência Nuclear Produzir óvulo anucleado Inserir novo núcleo Ex: ovelha Dolly Célula doadora quiescente Fusão celular 277 fusões - > Dolly DNA mitocondrial ≠

Transferência Nuclear Possíveis vantagens Produção de proteínas recombinantes Xenotransplante Desvantagens Ineficiência Anormalidades – embriões e gestação Idade genética - telômeros Padrões de metilação

Terapia Gênica Modificar expressão de genes Germ-line gene therapy Tratar, curar ou prevenir doenças Germ-line gene therapy Modificações em gametas Proibido na maioria dos países Somatic gene therapy Não passa para próxima geração in vivo e ex vivo Não tem muitos resultados positivos

Aplicações

Medicina Modelos de estudo: Terapia gênica Xenotransplante: Causas, progressão, estágios e sintomas de doenças cardiovasculares, auto-imunes, neurológicas, etc. Terapia gênica Xenotransplante: Transplante de órgãos e tecidos de animais em seres humanos Aumenta estoque de órgãos Grande obstáculo  sistema imune reconhece e destrói todas as células que não possuem marcadores específicos humanos na sua superfície (rejeição)

Medicina Xenotransplante: Porém, porcos transgênicos com gene que codifica uma proteína da superfície de células humanas  sistema imune não ataca Ou porcos transgênicos sem a enzima 1,3-galactosiltransferase na superfície do órgão animal  sistema imune não ataca Apesar do grande potencial  muitos outros estudos devem ser feitos (microrganismos latentes, questões éticas, etc.)

Pecuária Introdução de características desejáveis: Menos tempo e mais precisão Sem cruzamento seletivo, nem uso de hormônios Exemplos: Vacas  dão mais leite ou leite com menos lactose ou com menos colesterol Porcos e bovinos  produzem mais carne, resistente a doenças Ovelhas  produzem mais lã

Pecuária Animais como biorreatores: Produção de proteínas recombinantes humanas de grande interesse biológico e comercial, como enzimas, hormônios e fatores de crescimento Geralmente são expressas no leite  suprir carências nutricionais, tratar doenças (hemofilia, por exemplo), etc. Eles adicionam o fator IX no leite, responsável pela coagulação do sangue (esta proteina está ausente nos hemofílicos).

Indústria Indústria farmacêutica: Utilização de modelos animais (camundongos) no desenvolvimento de novas drogas. Um gene é retirado do genoma do animal pela técnica de knockout e, em substituição, um gene humano é inserido pelo método de adição gênica. Facilita o desenvolvimento de novos medicamentos, diminui custos e tempo.

Outros Exemplos

Terapia com células-tronco embrionárias em humanos Janeiro 2012 Terapia com células-tronco embrionárias em humanos Tratamento em 2 mulheres Injeções nos olhos Células injetadas foram derivadas de uma antiga linhagem de CTEs Tratamento imunossupressor Melhora pequena, mas animadora http://www.robertlanza.com/

Caso Malária/Dengue Malária  2,1 milhões de mortes por ano no mundo

Caso Malária/Dengue Áreas endêmicas: O que fazer então? Programas de prevenção, combate e controle dessas doenças estão comprometidas O que fazer então? Utilizar mosquitos transgênicos para bloquear ou reduzir a transmissão da doença Modelos para estudo é o da malária aviária (serve como base antes de testar o sistema da malária humana)

Caso Malária/Dengue Como? Conhecer o ciclo de vida do parasita dentro do mosquito Para o parasita penetrar nas glândulas salivares do mosquito, ele precisa estar recoberto pela proteína CSP Existe um soro (N2H6D5) que funciona como anticorpo para a proteína CSP e impede a passagem do parasita para a glândula salivar

Caso Malária/Dengue Construíram um gene para produção deste anticorpo Introdução do transgene no mosquito através de vírus recombinantes Mosquitos expostos a pintainhos infectados com o parasita (Plasmodium gallinaceum) Mosquitos que expressam o transgene reduziram 99,8% o número de parasitas na glândula salivar Ainda em testes.. Muitas outras coisas precisam ser consideradas (ver se não atrapalha o metabolismo do mosquito, etc.)

Considerações Finais

Considerações Finais Ferramenta muito poderosa Auxilia muito no desenvolvimento da medicina Permite a prevenção, tratamento e cura de doenças Mas exige muita pesquisa: Não pode haver equívocos É necessário conhecer todas as consequências da introdução de um novo gene no organismo Deve atuar em conjunto com outras técnicas Medicina, principalmente. Tratamento principalmente das doenças que antes não haviam nenhuma possibilidade de cura.

Considerações Finais Apesar do intenso estudo e pesquisa sobre animais transgênicos e suas consequências Muitas pessoas não aceitam! Esse é um ponto que a gente não pode deixar de falar... Não aceitam por motivos religiosos, medo de algum desastre ocorrer, ou simplesmente por ser contra (sem algum motivo).

Considerações Finais Pressão popular pode atrapalhar o desenvolvimento das pesquisas Como lidar com esta situação? Como demonstrar a confiabilidade destas pesquisas?

Referências Bibliográficas CAPURRO, M.L.; et al. Mosquitos transgênicos. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, 2001. LANZA, R.; et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. The Lancenet, 2012. PESQUERO, J.B.; et al. Animais transgênicos. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, 2002. PESQUERO, J.B.; et al. Aplicações dos animais transgênicos. Scientific American Brasil, 2007. REECE, R.J. Analysis of genes and genomes (Cap. 12 e 13) 2004.