A Expressão de Colágeno VI durante o desenvolvimento do coração de Zebrafish (Danio rerio) Aluno: Deivid Augusto da Silva Orientador: Gregory Thomas Kitten Laboratório do Desenvolvimento e Matriz Extracelular ICB – UFMG Dezembro - 2005

Estrutura Importância do Zebrafish como modelo Colágeno VI Desenvolvimento do coração Resultados Discussão

Vantagens do Zebrafish como modelo Ovos transparentes Fertilização externa Desenvolvimento rápido Alta fecundidade Pequeno tamanho – Não necessita de um sistema circulatório eficiente para desenvolver-se Capacidade de expressar mutações induzidas

Ovos transparentes e pequeno tamanho (http://pharyngula.org/images/larvae.jpg)

Estágios do desenvolvimento embrionário

Fotos do desenvolvimento

Animação do desenvolvimento

Domínios da molécula de colágeno VI 0 300 600 900 1200 1500 1800 2100 2400 2700 3000 aa CHU et al., 1990

Colágeno tipo VI: das cadeias  à microfibrila 3 Monômero 2 Dímero 1 Colágeno tipo VI Tetrâmero Microfibrila

Aspectos do desenvolvimento cardíaco Especificação de cada tipo celular: 16 hpf Endocárdicas X miocárdicas Atriais X ventriculares Migração celular e formação do tubo cardíaco na linha mediana Remodelamento do tubo cardíaco com a formação do coração funcional

(Satainier D.Y., 2001) Especificação das células precursoras Formação de grupos laterais As células endocárdicas migram mais medialmente que as miocárdicas Forma-se uma estrutura em forma de funil com 22 hpf Coração tubular com 24 hpf – batimentos cardíacos Looping com 36 hpf células ventriculares células atrias células do miocárdio células do endocárdio

Formação cardíaca Os precursores ventriculares estão marcados em verde e as atriais em vermelho As células ventriculares migram medialmente em relação às células atriais A fusão ocorre primeiramente na região posterior Na seqüência, há a fusão na área anterior, formando um alo central. Coração tubular com 24 hpf (Glickman e Yelon, 2002)

Formação dos Coxins endocárdicos De 1 a 2% dos nativivos apresentam alguma doença cardíaca congênita (HCD) Algumas das malformações cardíacas são devidas à problemas na formação dos coxins Alterações na expressão de colágeno VI são associadas à malformações Processo extensivamente estudado em outros modelos, mas o zebrafish apresenta vantagens, como a expressão de mutações induzidas Fornece um sistema simplificado da função gênica

A-B As células endocárdicas no canal AV são cúbicas, enquanto as restantes são pavimentosas C-D Expressam Dm-grasp, molécula de adesão superficial da superfamília das Igs. (Beis et al., 2005)

Com 55 hpf, as células cúbicas continuam expressando Z01, molécula associada a tight junctions, marcadora de tecido epitelial. Com 60 hpf, há diminuição na expressão de Z01, indicando a ocorrência de transformação epitélio-mesenquimal Durante esse processo, observa-se a migração das células endocárdicas pela ECM em direção aos miocárdicos Com 7 dpf, as valvas estão completamente formadas No coração adulto, observa-se a presença de 4 válvulas na valva atrioventricular (Beis et al., 2005)

Resultados Limitações: Dificuldade em obter cortes que contenham o coração e que estejam em uma boa orientação O microscópio confocal ter ficado estragado durante quase todo o semestre Forte marcação em uma área externa ao coração parecendo ser Hatching gland contidas no pericárdio

Colágeno VI – 48 hpf - Aumento 40 X A: Marcação para colágeno VI B: Morfologia C: Controle D: Imagem sobreposta de A em B B D

Colágeno VI – 48hpf - Aumento 63 X A: Marcação para colágeno VI B: Morfologia C: Controle D: Imagem sobreposta de A em B B D

Imunofluorescência do coração inteiro – Col. VI – 75 hpf

Discussão Forte marcação em uma área externa ao coração parecendo ser Hatching gland contidas no pericárdio Por quê no coração inteiro houve marcação ??? Necessidade de testar outros anticorpos Aprimorar técnicas de dissecação

Perspectivas Boas perspectivas, uma vez que em outros modelos já existem trabalhos semelhantes Entender a marcação de hatching gland Quando houver padronização das técnicas, fazer imunofluorescência e whole mount para outros colágenos.

Perspectivas e objetivos (Kolker S. J., 2000)

Obrigado pela Atenção! Agradecimentos À Deus, pela saúde e perseverança Aos meus pais e familiares À Cristiane, pelo carinho e amor incondicionais Ao Greg, pelos ensinamentos e paciência de um verdadeiro mestre Ao pessoal do laboratório, em especial a Elisandra e a Lorenza À Cleida, pela oportunidade e exemplo de organização Aos fornecedores de ovos de Zebrafish Aos colegas do PAD pelos momentos vividos E ao povo brasileiro, pelo financiamento. Obrigado pela Atenção!