LMA – Diagnóstico laboratorial Nydia S. Bacal LMA – OMS Leucemia Promielocítica Aguda LMA M3 clássica LMA M3 variante

Classificação da OMS

LMA 99P - LMA12 Robin Foá – Atibaia 03/2007

Vanderson Rocha – Board Review-MDAnderson/HIAE/ Junho 2007

LMA não categorizada > 60% dos casos de LMA Base para classificação é a morfologia, grau de maturação e citoquímica Não existem anormalidades citogenéticas recorrentes O critério diagnóstico é ≥20% de blastos na MO (em 500 células) ou SP (200 leucócitos) Se houver leucopenia acentuada pode se fazer esfregaços do buffy coat Biópsia de MO é necessária para o diagnóstico de leucemia aguda hipocelular em S.P. e M.O. Recomendações para classificação são aplicáveis apenas em amostras obtidas antes da quimioterapia.

IMUNOFENOTIPAGEM Fundamental para o diagnóstico de: LMA-M0 LMA-M7 Pode ser importante no diagnóstico de: LMA-M6b (Leucemia eritróide pura) LMA-M3 (hipogranular)

Diagnóstico Laboratorial LMA e LPA – LMA M3 Diagnóstico na rotina PML-RARα qualitativo PCR e FISH – HIAE PML-RARα quantitativo - Nichols– 72horas(s/ estabilidade) FLT3 qualitativo – Nichols NPM – Exon 12 – Nichols C-Kit – qualitativo – Nichols – 72horas(s/ estabilidade) CBFβ MHY11 (inv 16) – Quali/quantitativo– Nichols – 72horas(s/ estabilidade) FISH – envio de células AML1-ETO (t:8;21) – Quali e quantitativo – Nichols – 72horas(s/ estabilidade) FISH – HIAE MLL PTD 11q23 - FISH – HIAE Não Disponíveis: t(11;17) PLZF-RARα/NuMA- RARα/ t(5;17)NPM-RARα/ t(17;17)STSTSb-RARα CEBPα ; BAALC ; ERG ; NRAS ; Valor Prognóstico e Futuro

Forma Clássica - LPA - LMAM3 Faggot Cells Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007

Forma Variante LPA - M3v S. P.

Forma Variante LPA - M3v MO Citoquímica para MPO – deve ser fortemente positiva Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007

Forma Hiperbasofílica Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007

Diferenciação Granulocítica – MO normal Painéis de anticorpos monoclonais I II III IV V I II III IV V I II III IV V Mieloblasto Pro- Mielócito Meta- Neutrófilo mielócito mielócito Bastão CD34 CD117 HLA-DR CD117 CD13+forte CD33+forte CD13+forte CD33+forte CD13+fraco CD33+fraco CD13+ CD33+fraco CD13+forte CD33+fraco CD15 CD15 CD11b CD15 CD11b CD16 CD15 CD11b+forte CD16+forte CD34/CD117/CD45/CD13.33 CD16/CD13/CD45/CD11b Dra. Maria Silvia – Florianópolis Santa Catarina

Imunofenotipagem Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007

LMA M3 CD45xSS CD2xCD45 HLA-DRxCD45 CD34xCD45 MPO(c)xCD45 CD56xCD45 CD33xCD45 CD13xCD45 CD117xCD45 CD71xCD45

IMUNOFENOTIPAGEM Antígenos mielomonocíticos (CD13, CD15 e CD33) e ausência de expressão de antígenos monocíticos (CD14, incluindo My4, Leu M3 e Mo2) e ausência de HLA-DR Estudos iniciais - ausência de CD34 e CD7,mas Edward et al (1999) observaram que 41% dos casos de LPA com CD34 (+). HLA-DR (+) em LPA e HLA-DR (-) em LMA com morfologia não M3 Dr. Alberto Orfao – Universidade de Salamanca

LMA - TRIAGEM FENOTÍPICA DE ALTERAÇÕES GENÉTICAS t(8;21) MPO+, CD13, CD33, CD19+, CD56+ Comumente LMA-M2 t(15;17) MPO+, CD13+ heterogêneo, CD33++ homogêneo, CD15-, CD34-, HLA-DR- LMA Promielocítica – FAB M3 Hurwitz, CA et al, Blood, 80: 3182, 1992 Orfao, A et al, Haematologica, 84:405, 1999

111 casos de LMA de novo 38 morfologia de M3 (34 morfologia típica e 4 M3v) PML-RARα - 39 dos 111 (35%) 34 morfologias M3 e 5 casos foram classificados como M0 (2 casos), M1(1 caso) e M2 (2 casos)

ORFAO et al Quatro grupos conforme Morfologia / genética molecular 1) M3 / PML- RARα + (n=34) 2) Não-M3 / PLM-RARα + (n=5) 3) M3 com PML- RARα - (n=4) 4) Não-M3 / PML- RARα – (n=68)

ORFAO et al CD33 homogêneo nas células blásticas em 82% dos casos CD13 em todas as células leucêmicas com padrão heterogêneo de expressão (100%) Expressão de CD34/CD15 (100%) Discriminação entre M3/PLM-RARα (+) e M3/PLM-RARα (-) : ٭ padrão fenotípico CD34/CD15 ٭ expressão de CD13 ٭ presença de subtipo maior de células blásticas.

ORFAO et al A sensibilidade da imunofenotipagem para selecionar casos PLM-RARα foi de 100% e especificidade 99% HLA-DR negativo é provavelmente o achado mais específico ( 91%)

Expressão e quantificação do CD33 em LMA / LPA 256 512 768 1024 Spalice R. MO 14/11/02.003 FSC-Height -> 10 1 2 3 4 CD33 PE -> APL 80% Blasti CD33+ N O molecole CD33/cell = 23017 Petriconi R. MO 30/12/02.003 AML M4 80% Blasti CD33 + N O molecole CD33/cell =1648 FL3-H -> Petriconi R. MO 30/12/02.003 70% Blasti CD34+ CD33+ AML M2 N O molecole CD33/cell = 2992 256 512 768 1024 10 10 1 10 2 10 3 10 4 FSC-Height -> CD34 FITC -> Robin Foá – Atibaia – 03/2007 Caboni ext 19/12/02.003 Caboni ext 19/12/02.003

LEUCEMIA PROMIELOCÍTICA AGUDA (LPA) LPA é caracterizada por uma translocação específica t(15;17) t(15;17) envolve o gene receptor do ácido retinóico RAR-alpha no cromossomo 17 e o gene PML, um fator de transcripção, no cromossomo 15, gerando o gene quimérico PML-RAR-alpha o resultado da proteina quimérica PML/RARα é crucial para a patogênese da LPA Dr. Zago – Atibaia 03/2007

SLD de acordo com o grupo de risco citogenético-molecular Median:   Standard: 3.2 years (C.I. 95%: 38,6 - 60,6) Intermediate: 1.6 years (C.I. 95%: 36,9 - 63,1) High: 0.62 years (C.I. 95%: 39,2 - 59,7)   standard-risk: median DFS = 3.2 years intermediate-risk: median DFS = 1.6 years high-risk: median DFS = 0.62 years p<0.0001 years from CR standard: 85 events 47 intermediate: 56 events 34 high: 91 events 75 Mancini et al, Blood 2005

Translocações Cromossômicas Envolvendo o Gene RARα Genes X Genes X-RAR Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007

MÉTODOS DIAGNÓSTICOS Desvantagem Vantagem T Método Alvo Estrut. Artefatos, não define alvo para MRD Rápido, barato 1 dia Imunofluores. Proteína PML Núcleo Qualidade do RNA, falsos positivos Rápido, sensível, define alvo p/ MRD RT-PCR fusão PML/RARa RNA Laborioso, uso de radioativos, não define alvo para MRD Específico 7 dias Southern genes PML e RARα DNA Custo, não define alvo para MRD Céls. intérfase 2-3 dias FISH Crescimento em cultura; fusões crípticas não são detectadas, não define alvo para MRD 13-14 dias Cariótipo t(15;17) Cromosso mos Desvantagem Vantagem T Método Alvo Estrut. Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007

Imunofluorescência anti-PML 5’ 3’ DR5 RXR RAR PML RA LMA – não LPMa Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007

Tyrosine Kinase Receptor Mutations Acute Myeloid Leukemia Tyrosine Kinase Receptor Mutations Gene Mutation Frequency FLT-3 Duplication 15-30% Point Mutation 5-10% FMS Point Mutation 10-20% c-KIT Various <10%

Vanderson Rocha – Board Review-MDAnderson/HIAE/ Junho 2007

Core Binding Factor AML Prognostic impact of TK receptor mutations 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 FLT3 wildtype FLT3 mutation p<0.001 E F S (%) 1 2 3 4 5 6 years Robin Foá – Atibaia – 03/2007

Core Binding Factor AML Prognostic impact of TK receptor mutations 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 FLT3 wildtype FLT3 mutation E F S (%) p<0.001 1 2 3 4 5 6 years 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 c-KIT wildtype c-KIT mutation O S (%) p=0.03 1 2 3 4 5 6 years Robin Foá – Atibaia – 03/2007

LMA. Carcaterísticas clínicas de acordo com o status FLT3 FLT3 pos FLT3 neg Pts 150 (20%) 582 Idade(mediana) 15-60 (48.5) 16-60 (40.5) Sexo F/M 86/64 290/292 G.B.(mediana) 10.1-410 (126.0) 1.0-170 (28.2) Blastos (%) 50-100 (85) 12-98 (46) Robin Foá – Atibaia – 03/2007

Robin Foá – Atibaia – 03/2007

NPM 1 Kb Exon 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 10 12 Oligomerization MB Ac NLS Ac NLS Heterodimerization Mutations None (wild type) GATCTCTG....GCAGT....GGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAG Mutation A (77%) GATCTCTGTCTGGCAGT....GGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAG Mutation B (13%) GATCTCTGCATGGCAGT....GGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAG Mutation C (2%) GATCTCTGCGTGGCAGT....GGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAG Mutation D (2%) GATCTCTGCCTGGCAGT....GGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAG Mutation E (2%) GATCTCTG....GCAGTCTCTTGCCCAAGTCTCTTTAAGAAAATAG Mutation F (2%) GATCTCTG....GCAGTCCCTGGAGAAAGTCTCTTTAAGAAAATAG Pelo menos 40 variantes da mutação NPM já foram identificadas Falini et al., NEJM 352: 254-266, 2005

NPM MUTANTS LOCALIZE ABERRANTLY IN THE CYTOPLASM NIH 3T3 NPM wild-type NPM-mutated GFP NPMm GFP NPMwt C 86 47 WT Mutated WB: anti-NPM (376) Robin Foá – Atibaia – 03/2007

Tratamento: Fatores Prognósticos Pacientes idosos (>60 anos ? ; >80 anos) Sanz et al (PETHEMA+GIMEMA) Baixo risco: GB<10.000/μl e Plt>40.000/ μl Alto risco: GB≥10.000/ μ l Risco intermediário:GB<10.000/ μl e Plt<40.000/ μl Persistência do PML/RARα pós-consolidação Mau prognóstico mas não modificam o tratamento: CD56+, isoforma S do PML/RARα e mutações do FLT3 Não são fatores de mau prognóstico: anormalidades citogenéticas adicionais (30%) Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007

GIMEMA-AIEOP “AIDA” Trial Risco de recaída de acordo com monitoramento precoce de RT-PCR após consolidação 1 12 24 36 48 Months RT-PCR negative RT-PCR positive 0.2 0.4 0.6 0.8 Probability p=0.0001 Finally, before to conclude, I would like to advance preliminary results of the molecular monitoring studies carried out in these patients. RT-PCR was found positive in sixteen out of 37 patients in whom these data were available. Then fifty-seven percent achieved molecular remission at the end of the induction. However, only one of 21 patients tested at the end of Consolidation remained RT-PCR positive. Robin Foá – Atibaia – 03/2007

Sobrevida da LPA em pacientes tratados por recaída hematológica vs molecular 1.0 Molecular 0.8 0.6 Hematologico 0.4 0.2 P = 0.01 0.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 32 20 7 2 94 47 26 14 Robin Foá – Atibaia 03/2007

Expressões gênicas em LMA: grupos moleculares e resultados Clear correlation between cytogentic groups and gene expression (Kohlmann, 2003, Genes, Chrom Cancer) 54 AML pediatric samples with a different signature that is associated with outcome (Yagi, 2003, Blood) Identification of a HOX signature in samples with normal cytogenetics (Debernardi, 2003, Genes, Chrom Cancer) Robin Foá – Atibaia – 03/2007

Vanderson Rocha – Board Review-MDAnderson/HIAE/ Junho 2007

AmpliChip Leukemia MILE: Clinical Objectives Clinical accuracy of the microarray test as compared to standard leukemia laboratory methods (“gold standard”) n = 4000 patients Gold standard Diagnostic Information Microarray-based gene expression profile Morphology Cytogenetics Immunophenotyping FISH Cytochemistry PCR Robin Foá – Atibaia – 03/2007

AmpliChip Leukemia The “MILE” multi-center pre-marketing study Microarray Innovations in LEukemia A retrospective and prospective study to compare laboratory standard leukemia tests with a new microarray-based gene expression test Robin Foá – Atibaia – 03/2007

AmpliChip Leukemia Key hematological centers participating in Phase-I The MILE study will be conducted in collaboration with the European Leukemia Network plus US participants European Leukemia Network (WP13) Principal Investigator: T. Haferlach Site 1 Montpellier / France Site 2 Munich / Germany Site 3 Berlin / Germany Site 4 Rome / Italy Site 5 Padua / Italy Site 6 Salamanca / Spain Site 7 Cardiff / UK US Sites – Memphis, La Jolla Robin Foá – Atibaia – 03/2007

Accuracy by cross-validation: Classification performance of 17 - class algorithm: MDS not included in data set Accuracy by cross-validation: 95.65% based on 30fold CV HG-U133 Plus 2.0 2,647 samples for training Robin Foá – Atibaia – 03/2007

AmpliChip Leukemia Test MILES Stage I data presented at ASH conference 2006 [852] An International Multi-Center Microarray Study for the Molecular Classification of Leukemia Identifies Novel Sub-Groupings in MDS Overlapping with AML. Session Type: Oral Session Authors: Ken I. Mills, Torsten Haferlach, Jesus M. Hernandez, Wolf-Karsten Hofmann, Alexander Kohlmann, Mickey Williams, Lothar Wieczorek Date/Time: Tuesday, December 12, 2006 - 8:45 AM Session Info: Simultaneous Session: Myelodysplastic Syndromes: Molecular Biology (8:00 AM-10:00 AM) Robin Foá – Atibaia – 03/2007

Illumina

(direct contact with DNA) (promotes interaction with DNA) Core Binding Factor Genes Proteins  Subunity (direct contact with DNA) CBF AML-1 (21q22)  Subunity (promotes interaction with DNA) CBF

(direct contact with DNA) (promotes interaction with DNA) Core Binding Factor Genes Proteins  Subunity (direct contact with DNA) rhd Runt homology domain (RUNX1) AML-1 (21q22)  Subunity (promotes interaction with DNA) CBF (16p13) CBF

Core Binding Factor Translocations in AML CBF-MHY11 inv (16) rhd CBF MYH11 rhd CBF rhd ETO CBF AML1-ETO t(8;21) Wild type

5-12% AML 8 t(8;21) 21

5.139 CASOS DE DOENÇAS ONCOHEMATOLÓGICAS LEUCEMIAS MIELÓIDES AGUDAS – 912 casos analisados MDS – 59 casos / BIFENOTÍPICAS – 10 casos no HIAE 5.139 CASOS DE DOENÇAS ONCOHEMATOLÓGICAS (Novembro 1991 a Julho 2006)

Grupo de Citometria de Fluxo do Laboratório Clínico HIAE - 2007 OBRIGADA PELA ATENÇÃO ! Nydia nsbacal@einstein.br Grupo de Citometria de Fluxo do Laboratório Clínico HIAE - 2007 Ana Claudia Miranda Brito Alexandra Cavalcante Sonia Tsukasa Nozawa Ruth Hissae Kanayama

Diferenciação Monocítica – MO normal Painéis de anticorpos monoclonais I II III IV Monoblasto Promonócito Monócito Macrófago CD34 CD117 HLA-DR CD117 HLA-DR HLA-DR HLA-DR CD13+forte CD33+forte CD13+forte CD33+forte CD13+forte CD33+forte CD13+ CD33+ CD11b CD15 CD14 CD11b CD15+fraco CD14 CD11b CD14 CD34/CD117/CD45/CD13.33 CD14/CD33/CD45/CD34 Dra. Silvia – Florianópolis Santa Catarina