Avaliação da diversidade microbiana (Independentes de cultivo) Técnicas moleculares Expressões da diversidade

Avaliação da diversidade microbiana (métodos independentes de cultivo) Riqueza número de grupos presentes Equitabilidade abundância relativa de cada grupo Técnicas que envolvem ácidos nucléicos (RNA ou DNA). Essas técnicas permitem avaliar diversidade (quem está ali?) O potencial metabólico ou atividade quando genes metabólicos ou seus transcritos sejam usados nas sondas (o que fazem?) Métodos mais diretos e analíticos (como FAME).

Dogma Central da Biologia Molecular Sequências rRNA são extremamente importantes em estudos filogenéticos porque são conservadas (evoluiram lentamente) participando na síntese da estrutura dos ribossomos e de proteínas. rDNA indica os genes que codificam para o RNA ribossômico. A maioria dos genes metabólicos são regulados ao nível da transcrição e podem não ser expressos - potencial metabólico. Se o transcrito do gene é expresso então ele será expresso e seu produto será sintetizado - atividade metabólica.

Características dos ácidos nucléicos Dois tipos de ácidos: RNA e DNA DNA é codificado por 4 blocos intercambiáveis denominados bases: Adenina, Guanina, Citosina e Timina. RNA tem 5 bases diferentes: Adenina, Guanina, Citosina e Uracila.

Deoxyribonucleic Acid Ácido desoxiribonucleico DNA Pontes de hidrogênio e interações hidrofóbicas

Gene que codifica para rRNA 16S Porque os estudos de diversidade usam o rDNA? Gene que codifica para rRNA 16S Cerca de 1500 pb codificam para a subunidade 16S da molécula de RNA. Parte destas sequências são conservadas para a maioria dos seres vivos: -contém o passado metabólico do último ancestral comum. Regiões variáveis são usadas na taxonomia - filogenética

rDNA Mapa de variabilidade de SSU rDNA bacteriano Estrutura primária (sequência) e secundária (laços e dobraduras) ordenam a estrutura terciária (3D) dos ribossomos. Mapa de variabilidade de SSU rDNA bacteriano Vermelho = genes altamente conservados SSU (small subunit) 16S

Como se replica o DNA? Abertura da dupla fita via reações químicas simples e reconstituição da outra metade de cada fita por imersão em uma mistura composta pelas quatro bases. Cada base pode se combinar apenas com uma única base complementar. Portanto, uma base na “fita antiga” (+) define qual base pode ocorrer na “fita nova” (-) Dessa forma, após cada abertura da fita, são coletadas do substrato réplicas completas da fita original, exceto quando ocorrer uma mutação. (Complementaridade das bases)

Replicação do DNA O crescimento do DNA ocorre na direção de 5' para 3' Vídeo 1 Vídeo2 As duas fitas de DNA estão em direção opostas (anti-paralelas): uma das fitas tem a direção exata da sua síntese (5'---3') enquanto que a outra está invertida (3'---5'). Esta conformação em fitas anti-paralelas leva à necessidade de mecanismos especiais para a replicação do DNA.

Sondas de ácidos nucléicos Sondas de ácidos nucléicos Sondas são pequenas porções de DNA (ou RNA) de sequência conhecida usadas para identificar a presença de DNA complementar na amostra. Ocorre pareamento espontâneo resultante da complementaridade das bases. É o princípio das técnicas usadas para detectar e caracterizar genes. Tecnologia das sondas gênicas é usada para identificar genes individuais ou sequencias de DNA. A ligação das fitas (sonda + amostra ) se denomina IBRIDIZAÇÃO. Duas fitas devem ter pelo menos 16-20 bases complementares consecutivas para formar uma fita estável e complementar. 1. Sondas podem ser marcadas com: radioisótopos, enzimas, fluorocromo e substratos quimioluminescentes. 2. Hibridização pode ocorrer em suportes sólidos ou líquidos

Tipos de sondas gênicas Sonda é uma “assinatura das sequências genéticas de um organismo ou um gene” Tipos de sondas gênicas Sonda funcional - baseada nos genes de uma função específica. Sonda filogenética - baseada nas sequências das subunidades rRNA. Sonda de oligonucleotídio - pequena sequência, de 20 a 70 nucleotídios.

Técnicas de hibridização (detecção de biomoléculas) Dot-Blot A amostra (mistura que contém a molécula alvo) é aplicada pontualmente em uma membrana, depois aquecida para desnaturar o DNA; Adiciona-se sondas marcadas; A amostra é lavada para remoção da sonda não hibridizada e avalia-se os reagentes. Método qualitativo, As vezes difícil de interpretar, Simplificação dos outros métodos de hibridização.

Hibridização dot-blot. Detecta rapidamente a presença de biomoléculas Hibridização dot-blot Detecta rapidamente a presença de biomoléculas Não informa sobre os tamanhos das moléculas 100 % transgênico Hibridização dot-blot (DNA–DNA) entre o genoma de milho e um sonda 35S do CAMV (vírus do mosaico da couve-flor – promotor utilizado em transgenia). Linha superior: 1=100% transgênico; 2= 10% transgênico; 3= 5% transgênico; 4= 1% transgênico, 5= 0.5% transgênico; 6= controle negativo.; 7=água Linha inferior: 1=crioulo B1; 2=crioulo B2; 3=crioulo B3; 4=crioulo A1; 5=crioulo A2; 6= crioulo A3; 7= milho do Peru, controle negativo.

Southern Blot Fragments de DNA são separados por eletroforese O gel da eletroforese é tratado com álcalis para desnaturar a dupla fita. Transfere-se por contato o DNA desnaturado para uma membrana (nitrocelulose ou Nylon) Fixa-se o DNA na membrana por aquecimento (ou UV) Aplica-se uma sonda hibridizadora marcada (molécula de DNA conhecida e idêntica àquela que se quer encontrar). Lavagem para retirada do excesso de sonda Revelação por radiografia ou aparecimento de cor, caso a molécula alvo esteja presente.

Southern Blot Transferência do DNA para uma membrana Baseado no fato que fragmentos de DNA aderem a membranas de nitrocelulose ou Nylon: A membrana é colocada acima de um gel de agarose e abaixo de um material absorvente. Com o tempo os fragmentos de DNA se transferem do gel para a membrana por capilaridade. Após a transferência, a membrana é lavada e os fragmentos expostos a UV ou calor para fixação. A membrana torna-se uma imagem do DNA presente no gel.

Técnica do Southern Blot

Como são preparados os fragmentos de DNA? - Enzimas de restrição Endonucleases (ou enzimas) de restrição São proteínas que reconhecem sítios específicos das sequências de nucleotídeos e clivam ambas as fitas de DNA. “tesouras moleculares” Descoberta na década de 70 como um mecanismo de defesa de bactérias contra bacteriófagos, hoje é uma ferramenta da biologia molecular para fabricação de novas moléculas.

Southern Blot – Ex.: teste de paternidade Mãe: azul Pai: amarelo Seus 4 filhos : D1 (filha biológica), D2 (enteada, filha da mãe e ex-marido (vermelho), S1 (filho biológico), and S2 (filho adotivo,não relacionado biologicamente com pais).

Northern Blot (Utiliza RNA em vez de DNA, propiciando estudos de expressão gênica) Permite a investigação do peso molecular de um mRNA e avaliar quantidades relativas de mRNA em diferentes amostras. RNA (RNA total ou apenas mRNA) é separado por eletroforese. O RNA é transferido para membrana especial (nitrocelulose). A amostra é incubada com uma sonda de DNA (ou RNA) fita única marcada. A sonda hibridizará caso ocorra complementaridade formando uma molécula dupla fita (molécula RNA-DNA). A localização da sonda é revelada por incubação com uma substância que ligada a enzima converte-se produto colorido ou que exposta a raios X pode ser revelada.

Northern Blot

Hibridização em solução Ambos ácido nucléico-alvo e sonda interagem livremente na solução. Neste caso maior sensibilidade do que em suporte sólido Requer menos amostra Sonda deve ser fita única e não deve formar dupla hélice (auto anelamento). Adaptável a automação particularmente quando se usam marcadores quimioluminiscentes. Rápido: resultado em poucas horas.

Hibridização em solução

Biochips (Análise do perfil de expressão de comunidades) Microarranjos de DNA “DNA microarrays” Coleção de porções de DNA aderidas a suportes sólidos (vidro, plástico ou silicone) formando um conjunto que visa monitorar a expressão de múltiplos genes.

Biochips: microarranjos de DNA Um chip de DNA é um biosensor que analisa informações genéticas. Utiliza a complementaridade das 4 bases (A, T, G , C) no qual A emparelha com T e G emparelha com C através de pontes de H. Sequências de DNA contendo genes conhecidos (SONDAS de DNA) são colocadas num suporte em microsítios (alguns μm de diâmetro) e arranjados em filas. Genes extraídos de amostras e amplificados (PCR) são colocados no chip de DNA, possibilitando que caracteristicas como a presença de genes mutantes ou especificos sejam detectados através da hibridização. Importante para amostras ambientais, diagnóstico de doenças (câncer).

Como um biochip é produzido? Usa DNA, RNA ou oligonucleotídeos. Também podem ser de proteínas e de anticorpos. Permite a realização de milhares de reações biológicas de uma só vez.

Etapa 1: produção de sondas Usando técnicas convencionais, como PCR e síntese bioquímica, fitas de DNA específicas (sondas) são obtidas e purificadas. Existe ampla variedade de sondas no mercado

Etapa 2: preparação dos pontos de ligação Usam-se robótica e nano-manufactura para colocar em vidro ou plástico os receptáculos (substratos) das sondas de DNA.

Etape 3: integração das sondas Utiliza-se uma variedade de processos (eletroforese até ligação usando robótica) para aderir o material genético ao substrato. Condições de assepsia total nesta etapa (salas esterilizadas) para impedir contaminações.

Chip de DNA

Hibridização in situ Alvo: ácido nucléico em células intactas. Fornece informação sobre a presença de DNA específico e sua distribuição ou localização em tecidos ou superfícies. Sondas devem ser suficiente pequenas para atingir o DNA. Podem usar marcadores radioativos ou fluorescentes. Requer experiência para interpretação.

Hibridização in situ com fluorescência (FISH)

Fluorescent In Situ Hybridization - FISH Bactérias do grupo alvo aparecem em vermelho. Restantes bactérias aparecem em azul (cores artificiais)

Combinação de FISH com DAPI Permite a detecção simultânea do sinal da sonda de DNA e sua localização no cromossomo. Azul: corante DAPI Vermelho: Grânulos internos indicando bactérias ativas em processo respiratório. DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) é um corante fluorescente que se liga fortemente com o DNA.

Reação de amplificação do DNA – PCR (amplificação gênica) O objetivo é fazer um número elevado de cópias de um gene ou sequência. Células são separadas e lisadas DNA dupla fita é separado em fita única. Iniciadores (primers) são adicionados (pequenos fragmentos de DNA, 2-30 nucleotídios) Primers são segmentos complementares aqueles que flanqueiam a sequência alvo Apenas os segmentos DNA alvo entre os primers serão replicados Cada ciclo térmico de PCR consiste de 3 etapas: Desnaturação do DNA alvo (separação das fitas): 94 °C Anelamento por abaixamento da temperatura: 55 °C Extensão quando primers iniciam a síntese de DNA com uma DNA polimerase: 72 °C Cada ciclo resulta no dobro das sequências alvo (dura cerca de 60-90 seg). Geralmente usam-se 30 ciclos.

Taq polimerase É uma enzima termoestável isolada da bactéria Thermus aquaticus, que habita em regiões hidrotermais. "Taq polimerase" é uma abreviatura de Thermus Aquaticus Polimerase. É geralmente usada no PCR porque é razoavelmente barata e pode suportar as condições da técnica (temperatura de desnaturação).

PCR

PCR

O que fazer com PCR? Amplificar genes 16S rDNA diretamente de amostras ambientais. Usar primers específicos de certos grupos: detecção específica Detectar genes funcionais quando sua sequência é conhecida.

Métodos moleculares Sondas gênicas Hibridização Biochips PCR

Perspectivas - O futuro? Técnicas independentes de cultivo são essenciais, mas são lentas e trabalhosas. Como torná-las mais rápidas para utilizar em análises de comunidades microbianas? Processador automático Amostras ambientais Diversidade microbiana, atividade, potencial metabólico,... Aumentar automação Uso da robótica Tecnologia de microarranjos de DNA

Expressões da diversidade A diversidade refere-se tanto ao número (riqueza) de diferentes categorias biológicas quanto à abundância relativa (equitabilidade) dessas categorias. Inclui variabilidade ao nível local (diversidade alfa), entre habitats (diversidade beta) e entre paisagens (diversidade gama).

Expressões da diversidade Medidas objetivas Diversidade de Margalef (Diversidade alfa) É um índice simples que considera somente o número de espécies (n-1) e o logarítmo do número total de indivíduos. D = (n-1)/ln N onde: n é o número de espécies amostradas; N é o número total de indivíduos em todas as espécies. 2 = baixa diversidade > 5 = alta diversidade Outros índices: Diversidade de Gleason Diversidade de Menhinick Diversidade de Shannon-Wiener

Índices de heterogeneidade

Modelos de distribuição de abundância Modelos estatísticos que permitem observar variabilidade (número de espécies) e a equitatividade (distribuição da abundância relativa) Log-normal Série geométrica Broken stick Série logarítmica

Modelos de abundância Abundância Sequência das espécies Broken stick Log normal Série log Série geométrica Sequência das espécies

Características dos modelos: Série geométrica: pressupõe comunidades onde uma espécie preencheria um nicho e as demais ocupariam proporcionalmente frações de nicho remanescentes. Adequado para comunidades pobres e em estágios iniciais de sucessão. Série logarítmica: representa comunidades governadas por um único recurso, com os nichos remanescentes da ocupação de uma espécie sendo ocupados aleatoriamente. Comunidades mais maduras, em estágio mais avançado de sucessão. Broken stick: sugere uma comunidade com alta equitabilidade (heterogeneidade), regulada por fatores ambientais pouco variáveis. Modelo baseado em interações competitivas entre espécies de uma comunidade. Log normal: modelo satisfatório para a maioria das comunidades. Resultado do Teorema Central do Limite, que prevê a soma de muitos fatores independentes com pequenos efeitos.

Embora os modelos descritos possibilitem uma descrição mais completa dos dados de diversidade, há a necessidade de se empregar modelos de ajustamento, que podem ser trabalhosos e demorados. Além disso, as comunidades estudadas podem não se enquadrar em nenhum dos modelos. Neste sentido, os índices de diversidade provêm uma alternativa adequada para as medidas de diversidade (Magurran, 1988).

Sumário Diversidade tem dois componentes: - Variabilidade e Abundância relativa Etapas no cálculo: 1. Identificar o número de espécies 2. Avaliar o número ou biomassa dentro de cada espécie 3. Usar estes valores nas expressões Pode-se calcular em diferentes níveis de complexidade: - genético, espécies e comunidades As técnicas tem sensibilidades diferentes e incluem: - técnicas dependentes de cultivo - técnicas independentes de cultivo

Próxima aula: Estudos de caso FIM Próxima aula: Estudos de caso

Glossário molecular cDNA Fazer cópia do mRNA na forma de DNA Enzimas de restrição Cortar o DNA em pontos específicos, fragmentando-o DNA ligase Ligar fragmentos de DNA Vetores Transportadores de DNA para as células de forma a assegurar sua replicação Plamídios Tipo de vetor Transferência gênica Colocar um gene em uma célula Marcadores genéticos Para identificar células que foram transformadas Placas réplica Fazer cópias exatas de colônias bacterianas em placas 9 PCR Técnica de amplificação de DNA 10 Sondas de DNA Identificar e marcar um pequena porção de DNA que contenha um seqüência específica. 11 Shotgun Pesquisar um gene particular no genoma total 12 Genes antisense Parar a expressão de um gene na célula 13 Eletroforese Separar fragmentos de DNA