Avanços da Nanotecnologia Farmacêutica-1 aula-2 (12/03/08) qf-933 Prof. Dr. Nelson Durán MSc. Priscyla D. Marcato MSc. Zaine Teixeira IQ-UNICAMP

NANO (anão) 1 nm = 10-9 m

ALGUMAS DICAS Rede de Nanobiotecnologia: (www.nanobiotec.iqm.unicamp.br) Google: MIT OpenCourseWare (vários cursos completos) MIT OpenCourseWare BE.4625 (curso: Molecular Principles of Biomaterials) Conferencia(http://www.ranf.com/pdf/discursos/numero/vila.pdf) Rawat et al. Nanocarriers... Biol. Pharm. Bull. 29, 1790 (2006). Kayser et al. The Impact of nanobiotechnology... Current Pharm. Biotechnol. 6, 3 (2005).

3,5 bilhões de anos atrás - Células possuem biomáquinas nanométricas que têm funções como manipulação de material genético e suprimento de energia. Os químicos: Sintetizam polímeros (grandes cadeias de moléculas feitas de minúsculas unidades nanoescalares- monômeros) há muitas décadas

Abaixo de 100 nm as propriedades físicas e químicas mudam NANO X MACRO Abaixo de 100 nm as propriedades físicas e químicas mudam Aumento da área superficial = maior reatividade, maior penetração em células Novas propriedades óticas, elétricas e magnéticas

NANO X MACRO

NANO X MACRO

NANOBIOTECNOLOGIA É MULTIDISCIPLINAR Nanotecnologia Nanobiotecnologia Medicina Engenharias Informática Ciências dos Materiais Biologia Química Física

Rotas de administração de ativos Oral Nasal Parenteral (intravenosa, intramuscular, subcutânea) Dérmica Oftálmica

QUAL É A FUNÇÃO DOS ATIVO (FÁRMACO OU COSMÉTICO) NA ÁREA ESPECIFICA DE ATUAÇÃO? O FÁRMACO DEVE ATINGIR UM ALVO DEFINIDO COM EXATIDÃO CONTROLAR O MECANISMO DE PENETRAÇÃO DO FARMACO CÉLULAS OU TECIDOS

FORMA PRECISA NO ALVO E NO “MAGIC BULLET” (Paul Ehrlich) OS ATIVOS ESTÃO LONGE DESTE DESENHO O ATIVO É LOCALIZADO DE FORMA PRECISA NO ALVO E NO EXATO LOCAL DA AÇÃO NANOTECNOLOGIA

NanoBioTecnologia Encapsulamento de ativos (drug delivery) Biosensores Máquinas e dispositivos Moleculares Implantes médicos Engenharia de tecidos Descoberta de novos medicamentos

SISTEMA DE LIBERAÇÃO SUSTENTADA O princípio ativo é encapsulado em espécies coloidais como lipossomas, nano e micropartículas poliméricas ou lipídicas sólidas O princípio ativo pode estar associado a nanopatrículas metálicas e nanotubos de carbono Nanopartículas: diâmetro  1m Micropartículas: diâmetro > 1 m

Vantagens Melhora a estabilidade física e química de ativos Melhorar a biodisponibilidade Mantém o efeito do fármaco no tecido alvo Solubilizar ativos lipofílicos Minimiza os efeitos colaterais Reduz a toxicidade Diminui o número de doses/aplicações

Tempo/dosagem administrada LIBERAÇÃO SUSTENTADA Convencional Liberação ordem zero Efeitos adversos Níveis tóxicos Faixa terapéutica Concentração Min. efetiva Sem efeito Níveis Plasmáticos Tempo/dosagem administrada

Nanoemulsões Dendrímeros Ciclodextrina

Lipossoma Nanopartículas Lipídicas Sólidas Nanopartículas Poliméricas Nanopartículas Metálicas Fulerenos Nanotubo de Carbono

Preparação e Caracterização de Nanopartículas no Encapsulamento de Ativos/Fármacos

Top-Down X Bottom-Up A top-down e a bottom up A top down utiliza-se de metodos fisicos, como a litografia na miniaturizacao dos dispositivos, muito utilizada, por exemplo, na obtencao de transistores. Com a necessidade de miniaturizacao cada vez maior, na obtencao de dispositivos cada vez menor, a litografia acabou encontrando dificuldades, como a necessidade de radiacoes de energia muito alta, que requer fontes e sistemas opticos muito caros. A produção de mascaras tambem se tornou de alto custo, devido aa necessidade cada vez maior de minuaturizacao. E Menor tempo de uso por causa de estragos feitos pelos lasers de maior energia . Frente a essas dificuldades, surge a abordagem bottom-up, a qual se baseia na auto-organizacao dos chamados blocos de construcao sobre substratos, na construcao dos dispositivos nanometricos. Tais blocos de construçao seriam os átomos, moléculas ou particulas. Neste contexto, encontram-se as nanoparticulas metalicas funcionalizadas. http://www.barrettresearch.ca/teaching/nanotechnology/nano06.htm

Encapsulamento e liberação de ativos: Método Botton-Up através de moléculas auto-organização de moléculas em solução aquosa

Moléculas anfifílicas Reúnem dois grupos com polaridades ou solubilidades opostas lipídeos, surfactantes, proteínas

Estruturas de algumas moléculas anfifílicas típicas (Surfactantes não-iônicos) Alquilssulfato (surfactante aniônico) Sal de amina graxa (surfactante catiônico) Betaína (surfactante anfotérico) Polimeros em bloco fosfatidilcolina (fosfolipídios)

EMULSÕES Aula 2

Emulsão É uma dispersão, na qual as fases são líquidos imiscíveis ou parcialmente miscíveis. Neste sistema tem-se uma fase finamente dividida (dispersa ou interna) em uma outra fase (contínua ou externa), na presença de surfatante (agente emulsificante). Classificação (tamanho das partículas da fase dispersa): MACROEMULSÕES - >400 nm; MINIEMULSÕES – 100 a 400 nm; MICROEMULSÕES - transparentes, < 100 nm; MÚLTIPLAS – a partícula dispersa já é uma emulsão De Azevedo, 2004

Exemplos de tipos de emulsões A O O A A/O A A/O De Azevedo, 2004

Emulsão múltipla A/O/A Emulsão A/C Emulsão múltipla A/O/A H2O / óleo de parafina / emulsificador (copoliol cetildimeticona, lipofílico), A/O H2O / CO2 (l ou supercrítico) / emulsificante Neste caso não é qualquer emulsificante, tem que ter boa solubilidade em CO2 com fracas forças de dispersãodas cadeias (perfluoropoliéter) CF3 – (O-CF2- CF (CF3)n- (O-CF2)-COO- NH4+ Gota a gota, rpm H2O /emulsificador (SDS, hidrofílico), espessante (poli ácido acrílico),A De Azevedo, 2004

Conceito de tensão interfacial: Forças de dispersão (as chamadas forças de London):flutuações Presença de momentos de dipolo instantâneos inerentes às moléculas, que se reorientam o tempo todo Os momentos de dipolo de moléculas vizinhas são correlacionados e em decorrência,moléculas vizinhas sempre se atraem Existe uma energia superficial decorrente da existência destas forças intermoleculares, particularmente de dispersão De Azevedo, 2004

A é a área de contato entre as fases Conceito de tensão interfacial: Em conseqüência das forças intermoleculares, moléculas sempre se atraem e a tendência é a minimização da área superficial espontaneamente (variação da energia livre superficial ou interfacial com a variação de área) A = G T,P ,n  A é a área de contato entre as fases (Processo de aumento da superfície de um líquido) De Azevedo, 2004

INSTABILIDADE: 2 líquidos imiscíveis puros não podem formar uma emulsão: A tensão interfacial de valor alto representa uma energia livre interfacial alta, decorrente do aumento na área de contato entre as fases O sistema é instável termodinamicamente, se comparado à área mínima que se conseguiria entre as duas fases quando separadas. De Azevedo, 2004.

A maior parte dos sistemas que interessam são metaestáveis ( A energia livre do sistema tende a diminuir, mas este sistema é mantido no mesmo estado por uma barreira de ativação) Esta metaestabilidade está intimamente relacionada à presença de moléculas anfifílicas (surfatantes) na interface. (O/A, interface) Adsorve na interface L-L como um filme interfacial orientado Provoca abaixamento da tensão interfacial, o que leva à diminuição na energia livre interfacial Isto permite uma maior área de contato entre as fases água óleo óleo óleo interface De Azevedo, 2004

Instabilidade física das emulsões Mecanismos Floculação , sedimentação (“creaming”) reversível Coalescência irreversível Mecanismos Irreversível “quebra” Envelhecimento de Ostwald, separação de fases De Azevedo, 2004

Instabilidade Física das emulsões Dispersão: Movimento Browniano, Difusão Colisão efetiva Forças atrativas entre as gotas, formam-se agregados (floculação) Rompimento do filme interfacial e coalescência Paralelamente a estes fenômenos, as gotas podem flotar ou sedimentar (tamanho) “Ostwald Ripening” De Azevedo, 2004

Mecanismos de estabilização das gotas Abaixamento da tensão interfacial: A formação da emulsão é mais fácil, mas existem outros fatores de estabilidade Estérica: força repulsiva entre as cadeias (tamanho e solvente);La Mer: floculação x coagulação Eletrostática: carga do surfactante, adsorção de contra-íons.Repulsão governada pelo “overlap” entre as camadas difusas (potencial de Stern). Drenagem gera gradientes de [surfatante] mas há cura do filme Outros: natureza do filme interfacial, viscosidade da fase contínua De Azevedo, 2004

Estabilidade pela presença de partículas sólidas A partícula irá permanecer no líquido que molha melhor (ângulo de contato) Para deslocar a partícula da interface é necessário realizar trabalho Partículas de látex de poliestireno estabilizando uma gota de água na interface água/octano De Azevedo, 2004

dá origem à monocamada altamente organizada. Ordenamento das partículas de látex de poliestireno ( 2,6 m ) na interface água/octano Organizadas em monocamada com empacotamento hexagonal A mesma monocamada, após compressão: dobras e filme pregueado. Forças repulsivas laterais (originadas da carga superficial das partículas) dá origem à monocamada altamente organizada. De Azevedo, 2004

Seleção do surfatante como agente emulsificante Método do HLB (balanço hidrofílico-lipofílico, Griffin, 1949). O tamanho relativo dos grupos determina a curvatura preferida da interface, o que determina a fase dispersa Selecionar o surfatante ou uma combinação de surfatantes De Azevedo, 2004 hidrofilicidade

O/A x A/O Jacob Israelachvili (University of California) First World Congress in Emulsions, Paris, 1993 Hierarquia de forças e o tipo de estrutura auto-organizada que estabiliza: emulsões e micremulsões ocupam um lugar especial, energia da ordem de kT. Parâmetro de agregação crítica, CPP = Vap/ L A

HLB é indicativo apenas do tipo de emulsão que pode ser esperada ,mas não é indicativo de sua eficiência (concentração requerida) ou de sua contribuição à estabilidade da emulsão; Muitas maneiras de se calcular, ex: HLB= 20 * M hidrofílico/ M hidrofílico + M lipofílico (não-iônicos) O SONHO: Relacionar estrutura molecular do surfatante com HLB Exemplo: Etoxilados, HLB=13 mas acima de 80 0C forma emulsão A/O O PROBLEMA: Não acompanha mudanças nas condições (temperatura, co-surfatantes) De Azevedo, 2004

Método de PIT Shinoda e Saito (1969) definiram PIT como a temperatura na qual uma emulsão O/A torna-se A/O; Nesta temperatura as tendências hidrofílica e lipofílica do surfatante são perfeitamente balanceáveis. De Azevedo, 2004

Diagramas de fase para o sistema surfatante/óleo/água Winsor tipo I Winsor tipo II Winsor tipo III Região bifásica: tensoativo-água predomina tensoativo-óleo microemulsão 2 3 1 3 diferentes tipos de diagramas de fase, dependendo dos valores relativos de energia de interação do surfatante com óleo ou água; “tie line” seria horizontal para afinidades totalmente balanceadas De Azevedo, 2004

Preparação de emulsões A formação e estabilidade de uma emulsão é afetada pela seqüência e metodologia de mistura ( ex: emulsificador adicionado em separado, mistura de todos os componetes); a energia introduzida influi no diâmetro das gotas; forte tensão de cisalhamento pode levar a coalescência e polidispersidade (margarina O/W : componente de aroma na fase dispersa) Métodos Métodos de micronização – energia mecânica ao sistema, promovendo agitação dos 2 fluidos e do emulsificador (agitador) ultra-som: produção repentina e subseqüente colapso das cavidades em um líquido; crescimento da pressão local, subdivisão da gota (problemas de reprodutibilidade, controle dos núcleos de cavitação

Preparação de emulsões Métodos Inversão de fase: O/A preparada de uma emulsão A/O (menor gasto energético) PIT: pequenas gotas podem ser obtidas em T um pouco abaixo do PIT; consegue-se uma menor tensão interfacial

Aplicação : preparação de microesferas SEM, elétrons secundários (topografia) A=5000x (clorofórmio) De Azevedo, 2004

Emulsão múltipla na obtenção de microesferas para vacinas de DNA De Azevedo, 2004

Bibliografia-M.M.M.DE ACEVEDO(2004) [1] Rosen, M. J. Surfactants and Interfacial Phenomena, John Wiley & Sons: New Yok, 1989, 304-336. [2] Rosano, H. L., Gandolfo, F. G. e Hidrot, J-D. (1998). Stability of W1 /O/ W2 multiple emulsions, influence of ripening andinterfacial interactions Colloids Surf. A. 71, 109-121. [3] Lee, C. D., Psathas, P. A. e Johnston, K. P. (1999). Water-in-Carbon Doxide Emulsions: Formation and Stability., Langmuir 15, 6781-6791. [4] Hunter, R. J. Foundations of Colloid Science, Clarendo,Oxford,, 1991, 177. [5] Wnali, K., Yi, Liu et. al. ( 2000). Interactions between alkali/surfactant/polymer and their effects on emulsion stability/. Colloids Surf. A. 175, 243-247. [6] Taylor, P. (1995). Ostwald ripening in emulsions/. Colloids Surf. A. 99, 175-185. [7] Sjöblom, J., Emulsions and Emulsion Stability-Surfactant science Series (61), Marcel Dekker: New Yok, 1996, 1-41. [8] Adamson, A. W. e Gast, A. P. Physical Chemistry of Surfaces, John Wiley & Sons, 1997. [9] Israelachvilli, J. (1997). The science and applications of emulsions-an overview Colloids Surf. A. 91, 1-8. [10] Davis, H. T. (1994). Factors determining emulsion type: hidrophile-lipophile balance and beyond Colloids Surf. A. 91, 9-24. [11] Stein, H. N. The -Surfactant science Series (61), Marcel Dekker: New Yok, 1996, 1-41. [12] Becher., P.Encyclopedia of Emulsion Technology-vol.3, NY, M. Dekker Inc.,1988. [13] Lim, F. Bomedical Application of Microencapsulation, CRC Press, Inc. : Boca Raton, USA, 1985.

FORMAÇÃO DE AGREGADOS POR MOLÉCULAS ANFIFÍLICAS

Tensoativos ou agentes de superfície Surfactantes Tensoativos ou agentes de superfície “head” hidrofílica “tail” hidrofóbica

Surfactantes em solução cmc – concentração micelar crítica – faixa estreita de concentração Aparecimento de agregados (micelas) Myers, 1999; Fendler, 1982

Tipos de Micelas Jönsson e col., 1998

Cristais Líquidos Liotrópicos Número de Agregação Número de monômeros de surfactantes em cada micela no sistema aquoso constante em uma ampla faixa (~100 vezes cmc)  da concentração Formação de diferentes tipos de agregados organizados: mesofases liotrópicas Cristais Líquidos Liotrópicos

(mesofases termotrópicas) Efeito da temperatura sobre os tipos de agregados formados por surfactantes não-iônicos (mesofases termotrópicas) Cristais Líquidos Termotrópicos

Vesículas ou lipossomas multivesículas Fendler e col. 1982

Parâmetro de crítico de empacotamento, p Dependente da natureza do grupo polar e cadeia hidrofóbica, concencentração, temperatura, pH etc. Rodríguez-Hernández e col., 2005

MICELAS

Preparação de Micelas Gaucher e col., 2005 Diálise Emulsão o/a Equilíbrio simples Diálise ‘casting’ liofilização Emulsão o/a Gaucher e col., 2005

Modelos de Solubilização Rangel-Yagui e col., 2005

A introdução de moléculas ativas não muda significativamente o tamanho micelar. O método de preparação exerce influência sobre a quantidade encapsulada. Lukyanov e Torchilin, 2004

Eficiências de Encapsulamento Métodos convencionais como HPCL, absorbância no UV/VIS, fluorescência. Comumente variam de 1,5-50%. Lukyanov e Torchilin, 2004

Técnicas de Caracterização Espalhamento de luz dinâmico (DLS). Espalhamento de luz estático (SLS). Espalhamento de nêutrons a baixos ângulos (SANS). Espalhamento de raios X a baixos ângulos (SAXS). Microscopia eletrônica de transmissão (TEM).

Espalhamento de luz dinâmico (DLS) Intensidade de luz espalhada por partículas em suspensão em movimento Browniano. DT=kT/3d cálculo do raio de hidratação, d (raio de Stokes) Edwards e Baeumner, 2006

Espalhamento de luz estático (SLS) Tempo médio de espalhamento em função do ângulo. Informações sobre raio médio, massa molar e raio giratório. Edwards e Baeumner, 2006

Espalhamento de Raios X a Baixo Ângulo (SAXS) e Espalhamento de Nêutrons a Baixo Ângulo (SANS) Mede-se a intensidade de luz espalhada em função do ângulo de espalhamento. Interferências geradas por estruturas organizadas (seguem a lei de Bragg: d=n/2(1/sen=n) Informações sobre tamanhos, formas e organizações de partículas. Linder e Zamb, 1991

Small Angle X-ray Scattering (SAXS) http://srs.dl.ac.uk/arch/DALAI/SAXS.html

Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) Feixe de elétrons incidentes que interagem com a amostra de diferentes formas Informações sobre tamanhos, formas e organizações de partículas.

Aplicações de sistemas micelares no carreamento de bioativos PEG-b-PDLLA no encapsulamento do anticancerígeno Paclitaxel (formulação padrão com Cremofor EL, Taxol®) Aumento da eficácia, diminuição de efeitos colaterais Kim e col., 2004

Micelas baseadas em PEG-PE foram modificadas com o mAb 2C5, sendo reconhecidas por diversos tipos de tumores, conforme estudos realizados no encapsulamento de paclitaxel. Lukyanov e Torchilin, 2004; Gao e col., 2003

Micelas de PEG-b-Phis foram relatados na forma micelar quando em pH fisiológico. A acidificação do meio aquoso provoca a ionização progressiva dos segmentos de Polihistidina (Phis), expondo as moléculas encapsuladas. Gaucher e col., 2005; Lee e col., 2005

NANOPARTICULAS MICELARES COMERCIALIZADAS E EM DESENVOLVIMENTO FSD=female sexual dysfunction; PMH= post-menopausal hormone Marcato and Durán, J. Nanosci. Nanotechnol. 2007

CRISTAIS LÍQUIDOS

Técnicas de preparação similares aos de preparações de micelas. Sagalowicz e col. 2006

Modelos de Solubilização

Técnicas de Caracterização Medidas de viscosidade Microscopia óptica com luz polarizada. Espalhamento de luz dinâmico (DLS). Espalhamento de luz estático (SLS). Espalhamento de nêutrons a baixos ângulos (SANS). Espalhamento de raios X a baixos ângulos (SAXS). Microscopia eletrônica de transmissão (TEM).

Microscopia óptica Identificação das fases líquido cristalinos devido a observação de diferentes texturas. Ex. fase hexagonal apresenta textura do tipo leque. fase cúbica (isotrópica).

Microscopia óptica: exemplos de texturas fase líquido cristalina lamelar fase líquido cristalina hexagonal

Sagalowicz e col. 2006 Micrografias por cryo-TEM de uma fase hexagonal reversa (b); fase cúbica hexagonal reversa de uma dispersão de Dimodan U (c), vesícula a partir de uma fase lamelar a partir de uma mistura de Dimodan U e lactato de sódio esteárico (d); dispersão de micela de solução de polissorbato 80 (e). Sagalowicz e col. 2006

Aplicações Ciclosporina A, um peptídeo altamente lipofílico empregado no tratamento de inflamações dérmicas, foi encapsulado em fases cúbicas e hexagonais de monoleína, sendo que foi observado um aumento da permeação cutânea, além da diminuição da irritação. Lopes e col., 2006

Aplicações Furosemida como fármaco modelo em sistema líquido cristalino para aplicação oral. Foi obtida uma fase cúbica de monoleína que aumentou a biodisponibilidade do medicamento, além de promover uma liberação sustentada. Sallam e col., 2002

LIPOSSOMAS

Preparação de lipossomas Lipossomas: MLV, SUV, LUV

Preparação de lipossomas Lipossomas: MUV, SUV, LUV (http://www.avantipolarlipids.com/PreperationofLiposomes.html) jun/2006.

Modelos de Solubilização Fendler, 1982

Caracterização de lipossomas Número de lamelas Distribuição de tamanhos Composição e concentração de lipídios, além da eficiência de encapsulamento

Distribuição de Tamanhos Número de lamelas 31P NMR (adição de Mn2+ que suprime o sinal P) NMR dos fosfolipídeos da face externa dos lipossomas. SAXS Cyo-TEM Distribuição de Tamanhos DLS SLS HPLC-GEC-high-performance gel exclusion chromatography

Conteúdo de fosfolipídios Métodos colorimétricos NMR HPLC Outras caracterizações DSC na interação ativo/membrana NMR na organização das vesículas

Possibilidades de interações Chorilli e col., 2004

Limitações da Primeira Geração de Lipossomas

Segunda Geração de Lipossomas: “Stealth” Janof, 1999; Villanova e Consiglieri, 2000

Exemplo injeção em tumores sólidos, de maneira a reduzir efeitos colaterais e aumentar a citotoxicidade local. Após a injeção tumoral aproximadamente 90% dos lipossomas catiônicos permaneceram nos tumores. Hashida e col., 2005

Geração Atual de Lipossomas

Exemplos Os Lipossomas funcionalizados com transferina aumentaram a eficiência de transporte para as células endoteliais capilares cerebrais de uma droga modelo, através de receptores de transferina, em comparação com as formulações sem transferina. Visser e col., 2006

Exemplos Lipídios galactosilados em lipossomas no encapsulamento da doxorubina promoveram direcionamento da droga para hepatócitos. Wang e col. 2006

EXEMPLOS DE LIPOSSOMAS APROVADO PELA FDA Marcato and Durán, J. Nanosci. Nanotechnol. 2007

PRODUTOS LIPOSSOMAIS EM FASE CLINICA I/II APROVADA PELA FDA Marcato and Durán, J. Nanosci. Nanotechnol. 2007

PRODUTOS LIPOSSOMAIS EM FASE CLINICA III E IV APROVADA PELA FDA. Marcato and Durán, J. Nanosci. Nanotechnol. 2007

ALGUMAS VACINAS LIPOSSOMAIS EM DIFERENTES FASES CLÍNICAS Marcato and Durán, J. Nanosci. Nanotechnol. 2007

OUTROS TIPOS DE AGREGADOS ORGANIZADOS DE MOLÉCULAS ANFIFÍLICAS

Complexos de poliíons (PIC) no carreamento de bioativos. Yamamoto e col., 2001

Nanotubos de peptídeos Hidrólise parcial de -lactalbumina na presença de Ca2+ Condições mais severas de hidrólise do que na pasteurização Graveland-Bikker and Kruif, 2006

THE EMERGING FIELD OF NANOTUBE BIOTECHNOLOGY C. R. Martin and P. Kohli (NATURE REVIEWS | DRUG DISCOVERY, 2, 29 (2003).

Yu et al. Bioconjugate Chem. 16, 1484-1487 (2005)

Globular e Filamentos  Fibras Nanofibras de Oligopeptídeo Concentração Globular e Filamentos  Fibras Fung e col., 2003

Bibliografia Chorilli, M.; Leonardi, G. R.; Oliveira, A. G.; Scarpa, M. V. Lipossomas em formulações dermocosméticas. Infarma, 16 (2004), 75. Edwards, K. A.; Baeumner, A. J. Analysis of liposomes. Talanta, 68 (2006), 1432. Fendler, J. H. Membrana Mimetic Chemestry, John Eiley & Sons, New York, 1982. Fung, S.Y.; Keyesm, C.; Duhamel, J;Chen, P. Biophys. J., 85 (2003), 537. Gao, Z.; Lukyanov, A. N.; Chakilan, A. R.; Torchilin, V. P. J. Drug Target, 11 (2003), 297. Gaucher, G.; Durfresne, M. H.; Sant, V. P.; Kang, N., Maysinger, D.; Leroux, J. C. J. Contr. Rel., 109 (2005), 169. Graveland-Bikker, J. F.; Kruif, C. G. Trends Food Sci Technol., 17 (2006), 196. Hashida, M.; Kawakami, S.; Yamashita, F. Chem. Pharm. Bull., 53 (2005), 871. Janof, A. S. Liposomes Rational Design, Marcel Dekker, Inc, New York, 1999. Jönsson, B.; Lindman, B.; Holmberg, K.; Kronberg, B. Surfactants and Polymers in Aqueous Solution, John Wiley & Sons, Chichester, 1998. Kim, T. Y.; Kim, D. W.; Chang, J. Y.; Shim, S. G..; Kim S. C.; Heo, D. S.; Kim, N. K.; Bang, J. Y. Clin. Cancer Res., 10, (2004), 3708. Lee, E. S.; Na, K.; Bae, Y. H. Nano Lett., 5 (2005), 325.

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AGRADECIMENTOS REDE NANOTUB0S DE CARBONO CNPq/MCT CNPq/MCT