Clonagem Gênica 1-Introduçao 2-Estratégia geral de clonagem gênica 4-Vetores de clonagem plasmidial 5-Isolamento de gene por PCR Edmar Vaz de Andrade

1-Introduçao Tecnologia do DNA recombinante (TDR): conjunto de técnicas que permite o isolamento de fragmentos gênicos. Vetor + fragmento de DNA isolado DNA recombinante Multiplicação do DNA recombinante em uma célula hospedeira Isolamento e estudos para a caracterização do fragmento de DNA purificado (gene isolado)

1-Introduçao Tecnologia do DNA recombinante (TDR): conjunto de técnicas que permite o isolamento de fragmentos gênicos. Relevância: possibilita o isolamento e multiplicação de genes in vitro para posterior análise/caracterização Duas importantes classes de enzimas: Endonucleases de restrição (Tipo II) DNA ligase

2-Estratégia geral de clonagem gênica 1-isolamento de um fragmento de DNA 2-Inserção em um vetor de escolha (DNA recombinante ou quimera) 3-Transporte para o interior de uma célula hospedeira (transformação) 4-Seleçao de células transformantes (OGM) 5-Replicação da molécula de DNA recombinante 6-Multiplicação de células, cada uma contendo cópias do mesmo plasmídio recombinante (clones)

3-Clonagem gênica Clivagem Extremidades coesivas Clivagem do DNA pela enzima de restrição EcoRI Extremidades Coesivas

3-Clonagem gênica Fragmentos de DNA genômico Extremidades complementares Extremidades incompatíveis (b e c) não se ligam ao vetor Vetor de clonagem DNA recombinante Isolamento de fragmento gênico com enzimas de restrição tipo II Ligação de fragmentos isolados a um vetor de clonagem pela DNA ligase

4-Vetor de Clonagem Plasmidial Região de Múltiplos Sítios de Clonagem Vetor Plasmidial de Clonagem Componentes básicos de vetor plasmidial de clonagem

pBR322: plasmídio para clonagem em Escherichia coli (1977) 4-Vetor de Clonagem Plasmidial 1-Origem de replicação em E. coli (10 a 20 cópias do plasmídio por célula) 2-Genes que conferem resistência a antibióticos 3-Sítios únicos para diferentes endonucleases de restrição pBR322: plasmídio para clonagem em Escherichia coli (1977)

Iniciadores específicos para Chromobacterium violaceum ATCC12472 5-Isolamento de gene por PCR Gene de phuA FW (BamH I) Rev (HInd III) DNA genômico de C. violaceum 5’ 3’ BamH I Hind IIII A-3’ 3’-A PCR Amplificação do gene de phuA de Chromobacterium violaceum Iniciadores específicos para Chromobacterium violaceum ATCC12472

5-Isolamento de gene por PCR Clonagem do gene de phuA