“Exposição à hiperoxia leva à morte celular no desenvolvimento cerebral” Hyperoxic exposure leads to cell death in the developing brain Uluc Yis a,*, Semra Hız Kurul a, Abdullah Kumral b, Serap Cilaker c, Kazım Tug˘yan c, Sermin Genc d, Osman Yılmaz e Brain & Development 2008 Oct ;30 (9): 556–562 Realizado por: Ana Graziela S. Antón1; Eduardo Carrari1; Rodolfo Bregion1. Coordenação: Paulo R. Margotto . www.paulomargotto.com.br 1 Ddos curso de medicina da Escola Superior de Ciências da Saúde – ESCS.

Obrigado! Dr. Paulo R. Margotto, Ddo Eduardo, Dda Ana e Ddo Rodolfo 25-10-2008

Introdução Evidências: prematuros apresentam elevada prevalência de comprometimento cognitivo e motor devido a encefalopatia hipóxico-isquêmica, hemorragia intracerebral, infarto cerebral. Mas: uso de concentrações supra-fisiológicas de O2 em UTINeo (ressuscitação, desconforto respiratório...)  altas concentrações de O2 exercem efeitos tóxicos; prematuros possuem menos antioxidantes enzimáticos; Hiperoxia: fator de risco aditivo para morte neuronal em RN que apresentaram asfixia intraparto; Poucos estudos analisaram os efeitos da hiperoxia no desenvolvimento cerebral.

Objetivo “investigar os efeitos da hiperoxia em diferentes regiões do desenvolvimento cerebral”.

Materiais e métodos Modelo animal: Em conformidade com as orientações do Laboratório Animal Experimental e aprovado pelo Comitê de Uso e Cuidados Animal do Dokuz Eylul University School of Medicine; Filhotes de ratos Wistar (IG semelhante) em 2 grupos acompanhados do nascimento ao 5º dia pós-natal P(5): caso (n=8): expostos, em câmara, a 80% de O2, com concentração do O2 controlada 2x/dia, umidade mantida a 80% e CO2 removido; controle (n=8): mantidos em local com ar ambiente (21% O2); Mães trocadas a cada 24h (prevenção de dist. respiratório no adulto); Determinação da concentração sanguínea de O2 : coleta em cavidade cardíaca esquerda (sob anestesia); Em P(5): sacrifício dos animais animais pesados, anestesiados com éter e tecidos cerebrais coletados. Desenvolvimento cerebral desses ratos (nesta idade pós-natal) é semelhante ao de um RN nascido com ± 24 sem de gestação.

Materiais e métodos Avaliação histopatológica: Realizada por investigador “cego” em relação ao estudo; Animais perfundidos por formalina, tecidos fixados em formol, processados em blocos de parafina, cortados em 6µm e corados com cresilo violeta; Imagens analisadas em microscópio equipado com câmera de vídeo, computador e software (padronizados).

Materiais e métodos Estimativa do hipocampo, córtex pré-frontal, córtex parietal, subiculum e córtex retrosplenial : Estimativa das áreas cerebrais em toda as amostras (de acordo com Mouse Brain Atlas); Densidade/contagem de neurônios determinadas com uso de software; Procedimentos realizados às cegas.

Materiais e métodos Detecção de morte celular in situ : Detecção de fragmentação de DNA com “deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick endlabeling (TUNEL)”; Morte celular detectada por ELISA: Para detecção de fragmentação de DNA; Técnica utilizada para detecção específica de fração citoplasmática de tecido cerebral; Peso dos cérebros: Após removido da cavidade craniana, encéfalos pesados em balança com sensibilidade de 0,0001g; Análise estatística: Valores apresentados como média ±SEM; Comparações: teste Mann-Whitney U; p<0,05: estatisticamente significativo.

Resultados Avaliação de pesos corporais e gasometria sanguínea: Média do peso corporal: sem diferença estatística (12.14 ± 0.69 vs 12.57 ± 0.53; P = 0.318); PaO2 arterial: 82 ± 2 mm Hg nas crias expostas a 21% O2 e 324 ± 18 mm Hg naquelas expostas a 80% O2 (n = 2 por grupo);

Resultados Efeitos da densidade neuronal em hiperoxia: TUNEL: revelou típicas características morfológicas de apoptose (condensação de cromatina e corpos apoptóticos); Seguem tabelas e figuras.

Resultados Efeitos da densidade neuronal em hiperoxia:

Fig. 1: efeitos da hiperoxia na densidade neuronal e TUNEL na região CA1 do hipocampo. Ampliações de secção coronal de CA1 tecidos cerebrais de ratos do grupo controle (A) e grupo de hiperoxia (B), coradas com cresilo violeta. A densidade neuronal é significativamente menor no grupo de hiperoxia. (C) Resultados de TUNEL imunorreatividade no grupo controle. TUNEL células positivas reforçada no grupo de hiperoxia (D) (setas). Fig. 2: efeitos da hiperoxia na densidade neuronal e TUNEL no córtex pré-frontal. Ampliações de secção coronal partir do córtex pré-frontal tecidos cerebrais de ratos do grupo controle (A) e grupo de hiperoxia (B), coradas com cresilo violeta. A densidade neuronal é significativamente menor no grupo de hiperoxia. (C) Resultados de TUNEL imunorreatividade no grupo controle. TUNEL células positivas significativamente reforçada no grupo de hiperoxia (D).

Fig. 3: efeitos da hiperoxia na densidade neuronal e TUNEL no córtex parietal. Ampliações de secção coronal de córtex parietal dos tecidos cerebrais dos ratos do grupo controle (A) e grupo de hiperoxia (B), coradas com cresilo violeta. A densidade neuronal é significativamente menor no grupo de hiperoxia. (C e D) Resultados de TUNEL imunorreatividade no grupo controle. TUNEL células positivas reforçada no grupo hiperoxia (E e F).

Fig. 4: efeitos da hiperoxia na densidade neuronal e TUNEL no subiculum. Ampliações de secção coronal de córtex parietal tecidos cerebrais de ratos do grupo controle (A) e grupo de hiperoxia (B), coradas com cresilo violeta. A densidade neuronal é significativamente menor no grupo de hiperoxia. (C) Resultados de TUNEL imunorreatividade no grupo controle. TUNEL células positivas reforçada no grupo de hiperoxia (D). Fig. 5: efeitos da hiperoxia na densidade neuronal e TUNEL no córtex retrosplenial. Ampliações da secção coronal de tecidos do córtex retrosplenial dos ratos do grupo controle (A) e grupo de hiperoxia (B), coradas com cresilo violeta. A densidade neuronal é significativamente menor no grupo de hiperoxia. (C) Resultados de TUNEL imunorreatividade no grupo controle. TUNEL reforçada nas células positivas grupo de hiperoxia(D).

Resultados Efeitos da hiperoxia em quebra da fita de DNA:

Resultados Efeitos da hiperoxia sobre a morte celular no ELISA: Fig 6: Comparação dos resultados teste ELISA morte celular (grama / absorvância proteína) entre os grupos controle e hiperóxia.

Resultados Peso dos cérebros: Fig 7: Comparação dos pesos dos cérebros entre controle e grupo de hiperoxia.

Discussão Estudo: Concentrações suprafisiológicas levam a reação apoptótica e neurodegenerativas, morte celular e diminuição da massa cerebral alteração do desenvolvimento cerebral; Morte celular relacionada à hiperoxia em todas as regiões estudadas locais importantes de controle cognitivo, motor, sensorial, além de funções de memória e aprendizagem.

Discussão Animais selecionados devido à semelhança com o desenvolvimento pós-natal de um RN nascido com ± 24sem de IG: Período crítico para o desenvolvimento cerebral; RN comumente intubados e recebendo quantidades excessivas de O2; Estudos sobre os efeitos da hiperoxia no desenvolvimento cerebral são escassos; Um estudo: exposição de prematuros à hiperoxia é importante fator de risco para desenvolvimento de paralisia cerebral, piora o resultado em RN com asfixia; Lembrar que em UTINeo existem muitos fatores de risco que levam a morte neuronal silenciosa (sedativos, antiepiléticos), que somam os riscos com a hiperoxia.

Discussão Mecanismos da hiperoxia responsáveis pela morte celular no cérebro em desenvolvimento ainda não são conhecidos; Hiperoxia: produção de radicais livres: -danos ao DNA-mitocôndria- membranas; -mudança na expressão de genes; -fosforilação de proteínas;

Conclusão Hiperoxia: Capaz de produzir morte celular no cérebro em desenvolvimento, assim como no pulmão e na retina; Estudo sugere que a morte neuronal induzida pela hiperoxia pode ter parte na responsabilidade da deficiência cognitiva e motora desenvolvida posteriormente em prematuros.

Consultem também: Danilov CA, Fiskum G. Hyperoxia promotes astrocyte cell death after oxygen and glucose deprivation. Glia. 2008 May;56(7):801-8 (A hiperoxia promove a morte celular do astrócito após deprivação de oxigênio e glucose) Impacto das práticas clínicas no cérebro em desenvolvimento Autor(es): Augusto Sola (EUA). Realizado por Paulo R. Margotto