Técnicas Citoquímicas Aplicadas à Embriologia Vegetal Eduardo João Pereira Junior Técnicas Citoquímicas Aplicadas à Embriologia Vegetal Disciplina: Elementos de Microscopia e Microanálise Docente: Profa. Dra. Maria Tercília V. de Azeredo Oliveira

● FLOR: Ramo modificado que porta os esporófilos (carpelos e estames) ● ANDROCEU (estames): filete(1) + conectivo(3) +antera bilobada(2) → 4 androsporângios ou sacos polínicos(4) ● GINECEU: estigma(1) + estilete(2) + ovário(3) com óvulos (4), (5- saco embrionário)

● ANDROSPOROGÊNESE E ANDROGAMETOGÊNESE ● Androsporogênese → formação dos andrósporos dentro dos androsporângios ● androgametogênese → desenvolvimento do andrósporo em um grão de pólen Lilium Lilium

● GINOSPOROGÊNESE E GINOGAMETOGÊNESE ● Ginogametogênese → formação do ginósporo no interior do nucelo (ginosporângio) Tabebuia pulcherrima

● GINOSPOROGÊNESE E GINOGAMETOGÊNESE Lilium

● GINOSPOROGÊNESE E GINOGAMETOGÊNESE ● Ginosporogênese → desenvolvimento do ginósporo em um ginófito (saco embrionário)

● FERTILIZAÇÃO

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Arabidopsis

Técnicas Citoquímicas

● Calose – Solução de azul de anilina ● Cora tecidos frescos ou fixados (10-15 min.) ● Elevando-se o pH para 9 ou 10 aumenta a intensidade da coloração mas diminui sua aplicabilidade como corante vital ● Resultado: A calose emite fluorescência verde/amarela ao ser observada em microscopia de epi-fluorescência com comprimento de onda da luz UV em 365 nm. Azul de anilina 0,005% K2HPO4 0,15M pH 8,2

● Polissacarídeos insolúveis – PAS ● Ótimo protocolo de coloração para identificar polissacarídeos insolúveis ● Utilizado para secções frescas, secções desparafinizadas, secções incluídas em glicol metacrilato ou epóxi. ● Grupos aldeídicos do tecido (principalmente se houve fixação com um aldeído) devem ser tratado com um agente bloqueador, p.ex. solução saturada de 2,4-dinitrofenil hidrazina em ácido acético 15% durante 30 min ● Lavar por 30 min. em água corrente ● Oxidar por 10 min. em ácido periódico 1% ● Lavar rapidamente ● Corar com reativo de Shiff ● Resultado: polissacarídeos se coram de púrpura, os núcleos podem se corar fracamente

● Lignina – Floroglucinol ● Usado freqüentemente com cortes á mão livre ● Gotejar uma a solução de floroglucinol sobre o tecido e incubar por 30 – 60 min ● Resultado: células lignificadas se coram de vermelho. A coloração não é permanente, o corante se degrada num curto período. Etanol 100 mL HCl 16 mL Floroglucinol 0,1 g

● Amido – IKI (Iodo-Iodeto de Potássio) ● Usado em cortes manuais ou incluídos ● Gotejar uma gota de IKI sobre o tecido e deixar reagindo por 5 min. ● Resultado: O corante se intercala na estrutura do amido resultando numa coloração escura. Água destilada 100ml Iodeto de Potássio 1 g Iodo 1 g

● Ácidos graxos, suberina e cutina – Sudan ● Cora cortes frescos e secções incluídas em historresina ● Coloca-se o corte em etanol 50% por poucos segundos, então adiciona-se o corante ● Incuba-se por 5 – 10 min. com o corante, que dever ser recém preparado ● Mergulha-se novamente em etanol 50% ● Montar em glicerina Etanol 70% 100 mL Sudan IV, Sudan Black 0,07 g ● Resultado: Os lipídios bem como a suberina e a cutina solubilizam o corante e torna-se distinguíveis. Sudan Black B pode ser usado para corar ceras fracamente

● Pectina – Vermelho de Rutênio ● Usado para tecidos fixados ou frescos ● As secções são mergulhadas numa solução preparada imediatamente antes do uso com de vermelho de rutênio a 0,005% ● Os tecidos são montados em uma solução de glicerina dissolvida ● Resultado: as substâncias pectínicas (lamela média) se coram de vermelho ou rosa.

● Clarificação de tecidos (Fluido de Herr) – Microscopia de Normanski ● Método indicado para visualizar células e tecidos delicados como óvulos e embriões intactos dentro dos óvulos/sementes em estádios iniciais ● Fixar o material em fluido de Navashin modificado por Randolph ●Dissecar (p. ex.) os ovário e mergulhá-los no fluido de Herr por pelo menos 24 horas ● Montagem: coloque o material sobre uma lâmina escavada com um pouco da solução de clarificação ● Cobrir com lamínula e observar em microscopia de contraste interferencial de Normanski Ácido Lático 20g Cloral Hidratado 20g Fenol 20g Óleo de Cravo 20g Xilol 20g

● DNA – 4’-6- Diamino-2-fenilindol (DAPI) ● Dissecção e fixação do tecido por 24 horas em solução de álcool etílico e ácido acético (3:1). ● Em seguida as peças são infiltradas em historesina e seccionadas em série em micrótomo ● As secções aderidas em lâminas de vidro são imersas em solução de 0,25 mg/ml-1 de 4’, 6-diamidino-2- fenilindol (DAPI), em tampão TRIS 0,05 M, e mantidas na temperatura ambiente e no escuro ● Em seguida, as secções são examinadas em microscópio de epi-fluorescência ● Resultado: Núcleos emitem fluorescência azul

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