EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO EM SISTEMAS POLIMÉRIDOS DE DUAS FASES AQUOSAS - SPDFA -

Extração Líquido-Líquido Operação Unitária de transferência de massa utilizada para separar componentes presentes em uma solução e/ou suspensão, distribuindo-os entre fases líquidas parcialmente solúveis ou insolúveis.

PURIFICAÇÃO DE PRODUTOS BIOTECNOLÓGICOS Adalberto Pessoa Junior - Extração Líquido-Líquido de Biomoléculas PURIFICAÇÃO DE PRODUTOS BIOTECNOLÓGICOS ELLBio Bioprodutos Intracelulares Bioprodutos Extracelulares Rompimento Celular Purificação Separação de Células Acabamento BIOPRODUTO Clarificação 3

EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO DE BIOMOLÉCULAS ELLBio EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO DE BIOMOLÉCULAS Sistemas Poliméricos (PEG) de Duas Fases Aquosas (SPDFA) Sistemas Micelares Reversos (SMR) Sistemas Micelares de Duas Fases Aquosas (SMDFA) Vantagens comuns aos 3 métodos Rápidos Baixo custo Biocompatíveis

Processo de separação de fases Meio inicial: solução e/ou suspensão                 Fase Líquida II (inferior) Fase Líquida I (superior)                Sistema de duas fases   - massa Fase Líquida Inicial                                                                                                             Meio inicial: solução e/ou suspensão A FI AFII K = transferência de massa FP = Ae(fase ext) Ae(inicial) R(%) = AFI Ainicial . 100

Tipos de Sistemas Poliméricos Fundamentos separação – em função da diferença de solubilidade da biomolécula nas fases Tipos de Sistemas Poliméricos Dois polímeros não-iônicos: PEG x Dextrana PEG x Polivinil álcool PPG x Dextrana Metil Celulose x Hidroxipropil dextrana 2) Polieletrólito x Polímero não-iônico Sulfato dextrana de sódio x polipropileno-glicol Carboximetilcelulose de sódio x metil celulose

3) Dois polieletrólitos Sulfato dextrana de sódio x carboximetildextrana de sódio Carboximetildextrana de sódio x carboximetilcelulose de sódio 4) Polímero não-iônico x Composto de baixa massa molar PPG x fosfato de potássio PEG x fosfato de potássio metoxipolietileno glicol x fosfato de potássio PPG x glicose PEG x glicose PEG x sulfato de magnésio PEG x citrato de sódio

Sistemas mais estudados Fase de fundo Sistemas mais estudados PEG x Dextrana PPG x Dextrana PEG x fosfato de potássio PEG x sulfato de magnésio PEG x citrato de sódio Sistemas PEG x SAL Rápida separação de fases Baixo custo Elevada seletividade na separação baseada na solubilidade

Formação do SPDFA depende da concentração dos componentes do sistema Curvas de Equilíbrio Diagrama de fases: ordenada: composição da molécula de maior concentração na fase de TOPO (PEG, por exemplo) abscissa: composição da molécula de maior concentração na fase de FUNDO (Fosfato, por exemplo) ambos os componentes do sistema estão presentes nas duas fases o diagrama pode ser construído, determinando-se a composição das fases em equilíbrio de uma série de sistemas pontos acima da curva binodal: formação de duas fases pontos abaixo da curva binodal: única fase Formação do SPDFA depende da concentração dos componentes do sistema

Curva de equilíbrio de um sistema PEG/fosfato Composição da fase Topo PEG (%massa) T Composição inicial M Linha de amarração ou “tie line” Curva binodal C B Composição da fase de Fundo Ponto crítico Fosfato (%massa) Curva de equilíbrio de um sistema PEG/fosfato

Linha de amarração sistemas cuja composição inicial encontra-se sobre uma mesma linha de amarração possuem a mesma composição final As relação de volumes entre as fases varia com a composição - de acordo com a razão entre os segmentos TM e BM Segmento TM – proporcional ao volume da fase de FUNDO Segmento BM – proporcional ao volume da fase de TOPO C - Ponto crítico – composições e volumes da fase TOPO e FUNDO são iguais. Sistema instável.

VOLUMES DAS FASES EM FUNÇÃO DAS CONCENTRAÇÕES DOS COMPONENTES DO SISTEMA DE EXTRAÇÃO POR SPDFA

Curvas binodiais de sistemas com PEG 6000 em diversos valores de pH A variação do pH altera a razão H2PO4-/HPO4-2  varia a composição o equilíbrio entre as fases Curvas binodiais de sistemas com PEG 6000 em diversos valores de pH

Curvas binodiais de sistemas com massas molares 600, 1500, 4000 e 6000 em pH 8,0

Não se trabalha com volume devido à alta viscosidade fórmula geral: HO-(CH2CH2)n-CH2CH2OH. PEG Massas molares: Abaixo de 1000 Daltons: líquido Acima de 1000 Daltons: sólido (pó, flocos) Prática: Soluções-Estoque 50% m/m Não se trabalha com volume devido à alta viscosidade

FATORES QUE INFLUENCIAM NO COEFICIENTE DE PARTIÇÃO (K) DE BIOMOLÉCULAS Interações Hidrofóbicas Cargas superficiais / pH Diferença de Potencial Elétrico entre as Fases Efeito de “Salting-Out” da fase salina Diferenças de Viscosidade Diferenças de Densidade Interações Bioespecíficas Diagramas de Fases (conc. PEG e sal, p. ex.) Massa molar da biomolécula

Fatores Ambientais Fatores Estruturais 1 Concentração de Polímeros 2 Tipo e Concentração de Sal 3 Ligantes 4 Massa Molar do PEG 5 pH 6 Temperatura 7 Tempo de Mistura e Separação Fatores Estruturais 1 Resíduos hidrofóbicos 2 Massa molar da Biomolécula 3 Formato da biomolécula

Coeficiente de Partição CTi - concentração, ou atividade, do soluto i na fase de topo CFi - concentração, ou atividade, do soluto i na fase de fundo.

Rendimento de Extração Rtopo = rendimento na fase de topo (%) Ctopo = concentração ou atividade da biomolécula na fase de topo (g/L ou U/mL) Cinicial = concentração ou atividade da biomolécula na amostra antes da extração (g/L ou U/mL)

Seletividade (S)

Balanço de Massa ou de Atividade (BM)

PEG/Potassium Phosphate Clarificação simultânea à purificação PEG/Sodium Citrate PEG/Potassium Phosphate Clarificação simultânea à purificação células na interface células no fundo Extração de retamicina (fase de topo) de meio contendo células de Streptomyces olindensis (fase de fundo) em SPDFA formados por PEG/citrato e PEG/fosfato: (1) PEG 400, (2) PEG 1500 e (3) PEG 6000).

Extrações baseadas em afinidade Têm como base a capacidade que as biomoléculas têm de reconhecer e se ligar a outras moléculas, especificamente Interações por afinidade: aumentam a partição - K  Kaf O ligante é ligado covalentemente ao polímero – em geral PEG  formação do complexo polímero-ligante-biomolécula O PEG reage facilmente com ligantes, pois contém hidroxilas substituíveis O ligante pode ser natural ou sintético

Escolha do ligante custo x benefício deve ser favorável o ligante deve ser bifuncional – um sítio de ligação para afinidade com a biomolécula e outro sítio para imobilização no polímero deve ser estável durante a imobilização deve ser estável durante o processo de extração não deve conter outros grupos que tenham afinidade por outras partes da biomolécula não deve ser tóxico disponível fácil rompimento da interação polímero/biomolécula.

Exemplos de material purificado por partição de afinidade Sistema Material purificado Ligante PEG/Dextrana -galactosidase APGP PEG/palmitato BSA e -lactalbumina Ácidos graxos PEG/fosfato Proteína A IgG humana Penicilina acilase Trimetilamina Tripsina Inibidor de tripsina Lipossomos Avidina Dext./Hidropr opildextrana. Quimosina pepstatina Módulos de carbohidrolases Domínios de ligação da celulose Membranas da glândula lacrimal Aglutinina de trigo Amido Glicoamilase Aglutinina de germe de trigo Membrana plasmática de fígado de rato Ácidos graxos de cadeia entre C2 à C18 Albumina do soro humano, ß-lactoglobulina, hemoglobulina, mioglobina Ácidos graxos saturados de cadeia entre C2 à C18 e insaturados de 18:1, 18:2 e 18:3, grupos acila e Benzoatos Albumina, lizozima, ribonuclease, α2- macroglobulina IgG com fluído de ferro magnetizado

Sistema de afinidade: fase superior rica em PEG-ligante e a molécula alvo a ser purificada e fase inferior rica em sal (sulfato de sódio) e contaminantes.

Processo de reciclagem do polímero

Proteínas purificadas por partição de metal-afinidade em SDFA Citocromo c de Candida krusei Cobre Hemoglobina bovina Cobre, Ferro Eritrócitos Cobre, Zinco 2macroglobulina Hemoglobina humana Fosvitina Ferro Oxinitrilase Desidrogenases alcoólicas, lactato e malato desidrogenase Cobre, Níquel, Zinco e Cádmio Linfócitos Cobre, Níquel, Zinco Lactato desidrogenase Células de mamíferos Peroxidase de nabo Peroxidase de soja Proteina de membrana: citocromo bo(3) ubiquino l oxidase c Lactato desidrogenase acoplada a resíduo de polihistidina

Biomoléculas nucleotídeo-dependentes purificadas em SDFA com afinidade a corantes. Sistema Biomolécula Ligante acoplado ao PEG PEG/ Dextrana Lactato desidrogenase Corante triazina Cibacron Blue F3G-A fosfato Eudragit-Cibacron Blue Fosfofrutoquinase de levedura Cibacron Blue F3G-A-PEG Isoenzimas de fosfatase alcalina Procion Yellow H-E3G-PEG Fosfoglicerato quinase Cibacron Blue-PEG Formato desidrogenase Xilose redutase Drimaren

Equipamentos para extração com sistemas de duas fases aquosas Extratores e colunas de extração líquido-líquido têm basicamente duas funções: 1. Estabelecer o contato entre as duas fases líquidas do sistema para possibilitar a transferência de massa 2. Separar os dois líquidos após a extração

Equipamento por estágios Misturador – decantador* Misturador – decantador em cascata vertical Equipamentos de contato diferencial Coluna de extração por estágios Coluna de extração spray* Coluna de extração com recheio Extrator de discos rotativos perfurados Extrator Graesser

Equipamentos centrífugos Mais importante: extrator Podbielniak Tambor cilíndrico com placas concêntricas Fase pesada é alimentada no centro do tambor enquanto a fase leve é alimentada na periferia do extrator Escoamento contra-corrente