Profa. Dra. Ana Elizabete Silva AVANÇOS DA CITOGENÉTICA MOLECULAR NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP

Décadas 70-80: estudo citogenético  identificação de cromossomos e regiões cromossômicas  diferentes alterações Perda: deleção monossomia Ganho: duplicação, amplificação trissomia, poliploidia Relocação: translocação inversão inserção

CULTURA CELULAR E BANDA G 500 bandas Resolução: ~6milhões pb ~50genes/banda >4 Mb

CITOGENÉTICA MOLECULAR Pinkel et al. (1986): Aplicações de técnicas de biologia molecular em preparações citogenéticas: sondas marcadas com fluorocromos Identificação de rearranjos cromossômicos de novo e cromossomos marcadores Detecção de alterações cromossômicas em núcleos interfásicos Estudo da estrutura e função de regiões cromossômicas específicas

TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA MOLECULAR FISH: Hibridação in situ fluorescente (aneuploidias, rearranjos, amplificação) SKY: Cariotipagem espectral (alterações estruturais - translocações) M-BAND: Bandamento colorido (inversão, deleção/duplicação) CGH: Hibridação Genômica Comparativa (perdas ou ganhos cromossômicos) Array-CGH: maior resolução (desbalanços genômicos)

HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE FISH

HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE FISH: técnica de mapeamento físico de DNA em que uma sonda de DNA marcada com fluorocromo é hibridizada ao cromossomo ou núcleo interfásico e visualizado em microscópio de fluorescência Resolução: ~0,3 Kb (300 pb)

DNA Alvo: cromossomo ou região cromossômica Sonda: segmento de DNA específico

http://www.fisiologia.kit.net/main/anime.htm - ANIMAÇÃO

ETAPAS Pré-tratamento: Ácido acético RNase e pepsina Desidratação Etanol Preparação da lâmina (DNA alvo) Denaturação: DNA alvo e sonda formamida a 70oC ou estufa temperatura de ~80oC Fluorocromos: Sondas FITC-fluoresceína (verde) Espectrum green ( verde) Rodamina (vermelho) Texas red (vermelho) Hibridização sonda/DNA (estufa a 37oC – câmara úmida - overnight) Lavagem pós-hibridização: tampão 2xSSC (citrato de sódio) Detecção da sonda e contracoloração: iodeto de propídeo (PI) ou DAPI

ETAPAS Material: -núcleos interfásicos: tecido fresco, congelado, cortes histológicos, esfregaços -cromossomos metafásicos: cultura celular

ETAPAS (Ácido acético, RNase, pepsina)

ETAPAS Hibridização (câmera úmida à 37oc) Tempo de vida limitado das lâminas:perda da fluorescência

TIPOS DE SONDAS Sondas que hibridizam estruturas cromossômicas específicas: -sonda alfa-satélite (centromérica) -sonda beta-satélite (satélite dos acrocêntricos D e G) -sonda satélite clássica (heterocromatina 1, 9, 16 e Y) -sonda telomérica (telômeros) Sondas de cópia única ou locus específica Sondas de cromossomo inteiro – Whole-chromosome painting

TIPOS DE SONDAS

TIPOS DE SONDAS

SONDAS CENTROMÉRICAS Enumeração dos cromossomos e aneuploidias

aneuploidias em núcleos interfásicos SONDAS CENTROMÉRICAS gastrite: -7 gastrite:+7 APLICAÇÃO: aneuploidias em núcleos interfásicos úlcera: +8 Carcinoma de esôfago: tetrassomia 11 (verde)

SONDAS LOCUS ESPECÍFICA del (21q11.2) Diagnóstico de doenças com microdeleção

SONDAS LOCUS ESPECÍFICA Deficiência da esterase sulfatase (Xp22.3)

SONDAS LOCUS ESPECÍFICA Adenocarcinoma gástrico: Deleção TP53 1 sinal vermelho Mucosa normal: TP53 (vermelho) 17 (verde) Deleção do gene TP53 em câncer gástrico

SONDAS WCP – Cromossomo Total

SONDAS WCP – Cromossomo Total Detecção de Translocação recíproca balanceada

SONDAS WCP – Cromossomo Total A- Criança com anomalias congênitas: sonda do cromossomo 4 (material extra, braço curto de um dos cromossomos 4 (seta), B-  Metáfase da mesma criança: sonda do cromossomo 9. Dois cromossomos 9 normais; a parte extra do cromossomo 4 identificada como tendo origem no cromossomo 9 (seta).

SONDAS TELOMÉRICAS

SONDAS TELOMÉRICAS Aplicação: -Deleções terminais -perdas teloméricas

SONDAS TELOMÉRICAS (cromossomo 5)

APLICAÇÕES DA TÉCNICA FISH Mapeamento de genes e sequências gênicas Estrutura e organização dos cromossomos Monitoramento de indivíduos/populações expostas à mutagênicos Identificação de rearranjos cromossômicos/ pequenas deleções Identificação de alterações cromossômicas em esperma Diagnóstico Pré-Natal e Pré-Implantação Monitoramento de pacientes leucêmicos/transplante de medula óssea (doador de sexo oposto) Diagnóstico de neoplasias

DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL E PRÉ-IMPLANTAÇÃO APLICAÇÕES DA TÉCNICA FISH DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL E PRÉ-IMPLANTAÇÃO

DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL: FISH Trissomias 13, 18 e 21 e monossomia X: aneuploidias mais comuns relacionadas com idade materna avançada e malformações fetais Citogenética convencional: diagnóstico em 8-15 dias FISH: resultado rápido (2-3 dias) em células do líquido amniótico não cultivadas

DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL: FISH

DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL: FISH Normal Trissomia do 21 Triplo X

DIAGNÓSTICO GENÉTICO PRÉ-IMPLANTAÇÃO 3 sinais vermelho: blastômero com trissomia do 21

DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS AMPLIFICAÇÃO GÊNICA CCND1, c-MYC, HER2/Neu TRANSLOCAÇÕES t(9,22); t(8;14) DELEÇÕES TP53 (17p13), RB (13q13)

DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS Amplificação Gênica

DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS Amplificação Gênica (C-D) Amplificação Her-2 ( vermelho) – câncer de esôfago e gástrico (E-F) Polissomia 17 (verde) gene Her-2 (vermelho)

DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS TRANSLOCAÇÃO

DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS TRANSLOCAÇÃO

CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY

CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY Schrock et al., Science 273:494-497, 1996 Identificação precisa e simultânea de todos os cromossomos humanos: diferentes cores Princípio: medição simultânea de todos os pontos do espectro emitidos pela amostra na faixa espectral visível e próxima a infra-vermelha: uso de múltiplas sondas sobrepondo-se espectralmente Sondas: com 5 diferentes fluorocromos : Cy2, Spectrum green, Cy3, Texas red e Cy5 e suas combinações

CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY Sondas dos 24 cromossomos humanos marcadas com 5 fluorocromos em combinação resultando em uma cor diferente para cada cromossomo.

CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY Classificação das cores pseudo-coloridas Cor capturada

CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY Cromossomos marcadores Cariótipo normal

CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY Inverted-DAPI (A) and SKY classified (B) karyotypes of the previous lung SCC cell. -6 -8 A B t(1;16) t(5;9;13) t(6;8;15) t(6;7) t(6;15) t(11;19) Limitação: -Cultivo celular – metáfases -Não detecta deleções/duplicações e inversão

CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY Evolução cariotípica: células de gibão hibridizadas com sondas humanas  várias homologias cromossômicas

BANDAMENTO COLORIDO CROSS-SPECIES COLOR BANDING

BANDAMENTO COLORIDO Permite a coloração sub-regional dos cromossomos para análise do cariótipo humano Sondas: derivadas de primatas (gibões) do genêro Hylobates concolor e Hylobates syndactilus: cariótipos com extensa reorganização cromossômica quando comparado ao homem Identificação de rearranjos cromossômicos: inversões, deleções, duplicações, inserções, translocações

BANDAMENTO COLORIDO mBAND do cromossomo 5: 25 bandas coloridas: corresponde a uma resolução de 550 bandas (complemento haplóide)

BANDAMENTO COLORIDO Cromossomo 5 humano mostrando a imagem direta (a) e a imagem re-processada (b), ambas esteroscópicas. Qualquer alteração pode ser detectada por este sistema. 

HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH

HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH Método para detectar simultaneamente ganhos e perdas de regiões genômicas sem precisar de células em divisão Extração do DNA: células teste (tumor) e referência (normal) DNA digerido com enzimas de restrição e marcados com fluorocromos diferentes (vermelho e verde) Hibridação simultânea com ambos DNA (teste e referência) sobre lâmina com cromossomos metafásicos normais Comparação intensidade relativa dos dois fluorocromos ao longo do comprimento de cada cromossomo

HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH http://www.empiregenomics.com/site/technology_overview.php

HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH Amplificação/ganho: excesso do DNA teste (verde) Deleção/perda: excesso do DNA normal (vermelho)

HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH http://www.sanger.ac.uk/HGP/Cytogenetics/

HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH

Hibridização Genômica Comparativa (CGH) em câncer gástrico (Guan et al

array - CGH -cromossomos metafásicos substituídos por sondas de DNA ou oligonucleotídeos  chips DNA Resolução: 0,5 Mb

array - CGH Análise dos sinais fluorescentes: analisador de imagem, scanner confocal ou câmera CCD http://www.dkfz.de/en/genetics/pages/projects/array_cgh.html

array - CGH

AVANÇOS TECNOLÓGICOS 1o. Microscópio -Leeuwenhoek

AVANÇOS TECNOLÓGICOS

Array-CGH continua transformando a Citogenética: -fornecendo alta-resolução -tecnologia avançada para mapeamento preciso e detecção de aberrações cromossômicas. http://www.empiregenomics.com/site/technology_overview.php