Caracterização de genes de resistência a insetos Marcelo Menossi Laboratório de Genoma Funcional Centro de Biologia Mol. Engenharia Genética http://cafe.cbmeg.unicamp.br

Coffea arabica (75%) e Coffea canephora (25%) Café no Brasil Coffea arabica (75%) e Coffea canephora (25%) 13 estados produtores 9 milhões de empregos diretos e indiretos 2 bilhões de dólares em receita 2 milhões de hectares 150 cooperativas e empresas exportadoras registradas 1.500 indústrias de torrefação e moagem Segundo país maior consumidor do produto

Estresse Biótico e o Café Nematódeos Meloidogyne sp. Fungos Ferrugem do café (Hemileia vastatrix) Insetos Broca do Café (Hypothenemus hampei) Bicho mineiro (Leucoptera coffeella)

Ciclo de vida do bicho mineiro Incubação dos ovos à eclosão Das lagartas - 4 a 6 dias Desenvolvimento da lagarta - 7 a 11 dias (dano) Mariposa Oviposição  Formação da crisálida Eclosão da lagarta Duração da fase pupal – 5 a 8 dias Duração da fase adulta - 5 a 20 dias (fêmeas)

Cultivares resistentes Instituto Agronômico de Campinas - Hibridações entre C. arabica e C. racemosa (resistente) - Avaliação da quinta geração de retrocruzamentos Indivíduos resistentes e suscetíveis

Defesas contra herbivoria Defesa Constitutiva- Barreiras Físico-químicas Defesa Induzida - Expressão gênica Transdução de sinal Reparação do tecido Ajuste metabólico Inibição do crescimento do predador

Objetivos Identificar e caracterizar a expressão de genes que possam estar relacionados com a expressão da resistência do cafeeiro ao bicho-mineiro Avaliar esses genes como possíveis marcadores moleculares de resistência ao bicho-mineiro

Arranjos de DNA Arranjos em lâmina - Microarrays Arranjos em membrana - Macroarrays

Arranjos de DNA * * * * * * * * * * * * * Hibridação Detecção do sinal Macroarray A1 Macroarray A2 768 ESTs duplicata 12 x 8,5 cm Hibridação * * * * * * * * * * * Sonda células controle Sonda células tratadas * * Detecção do sinal e análises

Bibliotecas de subtração Enriquecidas em cDNAs diferencialmente expressos Driver Tester genes sem interesse genes de interesse Driver Driver e Tester Tester Sem amplificação Amplificação Exponencial Amplificação Linear Tester Enriquecido Eliminado

Avaliação do nível de resistências das plantas Resultados Avaliação do nível de resistências das plantas Resistentes 1 2 Suscetíveis 3 4

Experimento de infestação Controle (sem infestação) Rc e Sc Resistentes e Suscetíveis 3 dias pós infestação (oviposição) Ro e So 7 dias pós infestação (eclosão) Re e Se R S C O E C O E

Estratégia - Biblioteca de Subtração Resistente controle Suscetível controle Suscetível após oviposição Suscetível após eclosão Resistente após oviposição + Resistente após eclosão Tester (genes de interesse) Driver (genes descartáveis) Genes induzidos preferencialmente nas resistentes pós infestação

Único ciclo de subtração Efeito de normalização Resultados subtração DP1 DP2 DP3 Representational Diference Analysis (RDA) Vários ciclos de subtração Não normalizada Supressive Subtraction Hybridization (SSH) RDA: 100 ng Tester e 10 g Driver SSH: 10 ng Tester e 0,52 g Driver Único ciclo de subtração Efeito de normalização

Resistente - pós eclosão Hibridação com sondas de cDNA Resistente - controle Resistente - pós eclosão Membranas de náilon contendo 768 clones da biblioteca de subtração, hibridadas com sondas de cDNA

Análise dos dados Normalização - Fator normalizador: intensidade do background das membranas em regiões que não continham spots Seleção - spots réplica apresentaram intensidade maior que 10% do background e com variação de sinal menor que duas vezes entre spots réplicas Cálculo da média entre spots réplicas ESTs cujo valor máximo das médias dos spots de um dos tratamentos com cDNA de plantas resistentes infestadas (Ro ou Re) for maior que duas vezes o mínimo de um dos outros tratamentos (Rc, Sc, So ou Se)

SOM- Self Organizing Maps 260 ESTs selecionados. C O E C O E Res Sus

Genes Induzidos (exemplos) 16,5% de clones de RDA (143) – alta redundância 17 % dos clones do SSH (117) – baixa redundância

Confirmação por northern blot Rc Ro Re Sc Se So SSH 101B04 SSH 201D09 SSH 104G04 SSH 202H06 SSH 202C10 DP3 102B11

260 genes diferencialmente expressos Análise da estratégia Subtração + Macroarray RDA- Ideal para amostras com diferença de indução de 10x SSH- Ideal para amostras contendo muitos transcritos diferencialmente expressos Falso positivos ? Tente conhecer seu modelo experimental 260 genes diferencialmente expressos

METABOLISMO SECUNDÁRIO DE AMINOÁCIDOS, AÇÚCARES E VITAMINAS Modelo inicial das defesas da planta Epiderme Mesofilo METABOLISMO SECUNDÁRIO TRÁFICO INTRACELULAR PROTEÓLISE Peptidase sinal SECY Metaloprotease Fosfocitidil sintase Flavonol transferase GTPase, Quinases, Trocador Na/Ca ? TRANSDUÇÃO DE SINAL FATORES DE TRANSCRIÇÃO MYB, Homeoproteína BELL Oviposição PROTEÍNAS EFETORAS ESTRESSE OXIDATIVO Eclosão Quitinases Inibidor de protease GST Catalase psaH FUNÇÃO DESCONHECIDA ESTRESSE ABIÓTICO METABOLISMO DE AMINOÁCIDOS, AÇÚCARES E VITAMINAS No hits Unknown protein Proteína associada à senescência RD22 – Proteína anti-seca Glutamato decarboxilase Tiamina sintase Acetil COA sintase

Próximas etapas Análise da expressão dos genes diferencialmente expressos Análise de segregação em Southern blot de plantas resistentes e suscetíveis

CNC PNP&D Equipe IAC CBMEG - Unicamp http://cafe.cbmeg.unicamp.br Dr. Oliveiro Guerreiro Filho Dra. Míriam Maluf Daniel Ramiro (MSc.) Silvia Chebabi (M.Sc.) IMECC – Unicamp Dr. Aluisio S. Pinheiro IQ-USP Prof. Dra. Mari Cleide Sogayar Dr. Mario Henrique Bengtson Christian Colin (Dr.) CBMEG - Unicamp http://cafe.cbmeg.unicamp.br Jorge Mondego (Dr.) Juliana de Maria Felix (Dr.) Rodrigo Drummond (Dr.) Renato Vicentini (IC) Cristiane Rocha (IC) Melina P. Duarte (IC) Dr. Marcelo Menossi CNC PNP&D União Européia