Controle Microbiológico de Produtos não estéreis

“Produtos não estéreis são aqueles nos quais se admite conceitualmente a presença de carga microbiana, embora limitada, tendo em vista as características de sua utilização”. Cosméticos, produtos farmacêuticos tópicos e orais Contato com áreas portadoras de flora microbiana natural!!! Atenção no CQ destes produtos deve assegurar que a carga microbiana presente (quali e quantitativo) não comprometa a sua qualidade final ou mesmo a segurança do paciente.

Altas cargas microbianas presentes no produto farmacêutico não estéril podem comprometer: A segurança do paciente e/ou usuário que não esteja saudável, dependendo ainda das características de utilização de cada produto. A estabilidade do mesmo, interferindo diretamente na sua qualidade intrínseca. A qualidade microbiológica de um produto não estéril é proporcionada pela adoção e respeito às Boas Práticas de Fabricação, sendo necessário e complementar às BPF a adição de conservantes.

Segundo RDC 162/01, é apresentada a definição de conservantes : “São substâncias adicionadas aos Produtos de Higiene Pessoal, Cosméticos e Perfumes com a finalidade primária de preservá-los de danos e/ou deteriorações causados por microorganismos durante sua fabricação e estocagem, bem como proteger o consumidor de contaminação inadvertida durante o uso do produto”.  “É permitida a associação de substâncias conservantes obedecidos seus limites individuais”.  “Em casos especiais, quando houver necessidade de utilizar-se uma concentração que ultrapasse os valores individuais estipulados na lista, a empresa deverá apresentar documentação técnico-científica justificando o seu uso”.

RDC 162 de 2001, estabelece a lista de substâncias de ação conservantes para produtos de higiene pessoal, cosméticos e perfumes.  Sistemas conservantes devem apresentar algumas características para suas substâncias: Possuir amplo espectro de ação microbiana; Não mudar as características organolépticas do produto; Não interagir com componentes da formulação; Ser estável em ampla faixa de pH; Devem incluídas nas formulações sob concentração mínima de eficácia e máxima descrita em legislação.

CQ tem como objetivo imediato – comprovar a ausência de microorganismos patogênicos e determinar o número de microorganismos viáveis, em função dos tipos de utilização do produto. Ex. consumidor ser debilitado ou imunodeprimido; Cosméticos em pele sensível – bebê. Cuidados quanto ao limite microbiano!!! Risco ao consumidor: Saprófitas – agentes infectantes oportunistas (deterioração de produtos) – TOLERA-SE CARGA MICROBIANA!!! Patogênicos (Salmonella, Pseudomonas, Staphylococcus) – risco de quadro clínico infeccioso – PROIBITIVO A PRESENÇA!!!

Estabilidade do produto: Perda da eficácia terapêutica – por degradação do PA: ou por alteração de parâmetro físico fundamental para sua atividade – ex. pH, ou alteração de propriedades físico-químicas – entre elas: produção de gases – odor desagradável, ação enzimática levando a degradação de tensoativos – quebra da emulsão ou alteração na viscosidade. PREOCUPAÇÃO COM AS POSSÍVEIS FONTES DE CONTAMINAÇÃO: DIRETAS: Fluidos gasosos, água e demais matérias-primas (principalmente origem natural). INDIRETAS: procedimentos de limpezas, instalações inadequadas, pessoal não paramentado, processos não validados...

Lembrar que a carga microbiana (CM) pode ser alterada durante o processo de fabricação ou mesmo durante o tempo de prateleira do produto, por diversos fatores: Fórmula: presença de proteínas e carboidratos (cosméticos) se a concentração não for hiperosmótica – favorece a elevação de CM. em contrapartida, presença de etanol, sorbitol, sacarose, propilenoglicol tendem a favorecer CM mais baixas, nas concentrações normalmente utilizadas em líquidos. Conservantes: usados com critério – podem interagir com componentes da fórmula e ter sua atividade reduzida. pH: microorganismos crescem em pH neutro, com efeitos inibitórios em faixas extremas (ácidas ou alcalinas).

Atividade da água: fundamental para sobrevivência de microorganismos Atividade da água: fundamental para sobrevivência de microorganismos. Portanto os produtos em água dependem de incorporação de conservantes. Recorrer quando possível às fórmulas extemporâneas!!! Processo: altas temperaturas reduzem CM, já temperaturas próximas a 40ºC tem efeito oposto. Água de condensação nas paredes de reatores, ou mesmo vapor de água na tampa de frascos durante o resfriamento podem ocasionar a proliferação de microorganismos

PADRÕES PRIMÁRIOS Apesar do reconhecimento, há muitos anos, da importância do controle microbiano de produtos não estéreis, a implantação dos padrões sanitários tem ocorrido lentamente. Este fato pode ser observado nas farmacopéias em que os padrões estão sendo incluídos gradativamente. As monografias farmacopeicas nas quais consta especificações para qualidade microbiológica, de forma geral, referem-se à ausência de uma ou mais espécies específicas. Apesar de a carga microbiana total também ser parâmetro de avaliação da qualidade sanitária do produto, o limite para o número de microorganismos viáveis é exigência apenas em algumas especificações.

A Portaria n° 600, de 28 de novembro de 1997, da Secretaria da Vigilância Sanitária, divide os cosméticos em dois grupos, tipo I e II, dependendo do local de aplicação. O tipo I refere-se a produtos para uso infantil, para área dos olhos e para aqueles que entra em contato com a mucosa. O tipo II, para demais produtos suceptíveis à contaminação. - Tipo I: menos que 102/g de microrganismos totais aeróbicos. Ausência de Pseudomonas aeruginoas, Staphylococcus aureus, coliformes totais e fecais em 1g; no caso do talco, ausência de Clostrídeos sulfito redutores, também em 1g. - Tipo II difere em relação ao primeiro apenas no limite de aeróbios totais que é de, menos que 103/g.

Medicamentos não estéreis e cosméticos!!! Métodos de análises: Amostragem (coleta, transporte e preparação da amostra). Determinação numérica ou contagem de formas viáveis. Isolamento e identificação dos microorganismos indesejáveis para serem pesquisados. Medicamentos não estéreis e cosméticos!!!

Amostragem A amostragem a ser efetuada para investigação quanto aos atendimentos aos padrões microbianos deve ser representativa. Barricas ou sacos de matéria-prima (pó) não estéril: coletar amostras na região inferior, mediana e superior na quantidade de √n + 1. Efetuar assepsia na área próxima à coleta de amostras, vedar em recipiente hermético a amostra. Em processos contínuos, a segmentação do processo deve estar contemplada na amostragem. Produto acabado – duplicata de amostra representando início, meio e fim do processo de enchimento e que após fechado a embalagem não existirá a introdução de contaminantes.

Coleta e Transporte das amostras Fazer as amostragens em local limpo; Operador treinado; Recipientes, dispositivos auxiliares (espátulas, pipetas) estéreis; Temperatura adequada para trasnporte.

Quantidade a ser analisada - Quantidade depende das análises e re-teste. Recomendação das principais farmacopéias: - Para enriquecimento na pesquisa de patogênicos: 10 g(mL) do produto em 90 mL da solução tampão pH 7 com inativante do conservante ou em solução salina com inativante do conservante. Obs. No caso de amostra total ser 10 g (mL) ou inferior, este total deve ser analisado. - A tomada de ensaio pode ser reduzida para 1 g(mL) em amostras com alto valor agregado.

Preparação da amostra - Verificar a presença de conservantes na fórmula. Os conservantes devem ser inativados – substâncias adequadas de acordo com natureza química. Ex. Sais de amônio quaternário 3% de polissorbato + 0,3% de lecitina. Ajuste do pH do produto diluído para a faixa de neutralidade. Homogeneização. - Tratamento da amostra para permitir contato íntimo da amostra com o meio diluente. - Produtos oleosos – adição de agente tensoativo.

Durante o preparo de amostras de produtos não estéreis para a contagem de microrganismos viáveis não patogênicos, é necessário o contato dessas amostras com diluentes biocompatíveis com as células microbianas. Alguns possíveis diluentes: - solução de NaCl à 0,9% estéril. - solução de NaCl à 0,9% e peptonada a 0,1% estéril. - solução tampão pH 7,0 estéril. - caldo lactosado estéril.

Exemplo de preparo de amostra para análise microbiológico de um cosmético em diluição decimal seriada: A diluição 1:10 de uma amostra de cosmético pode ser obtida homogeneizando: 1 g de cosmético + 9 mL de diluente, ou 10 g de cosmético + 90 mL de diluente, ou 20 g de cosmético + 180 mL de diluente, ou 25 g de cosmético + 225 mL de diluente, e assim por diante. Em todos os exemplos acima, a amostra resultante é diluída a 1:10 (10-1), e consequentemente, em cada mL da diluição teremos uma quantidade de amostra correspondente a um décimo de mL (0,1 mL) e 0,9 mL de diluente.

Semeadura da amostra em profundidade (Pour Plate) Métodos de Contagem de Microrganismos Semeadura da amostra em profundidade (Pour Plate) Análise quantitativa. Alíquota de 1 a 2 mL da diluição da amostra para réplicas (triplicata) de placas de Petri estéreis. - Meio de cultura não seletivo líquido, estéril, fundido e resfriado a temperatura (45-48°C), cerca de 20 mL é vertido sobre a placa contendo a amostra e homogeneização com movimento em 8 ou S. - Incubação na posição invertida após solidificação.

Semeadura da amostra em profundidade (Pour Plate) 8

Semeadura da amostra em superfície - Análise quantitativa. - Meio de cultura não seletivo ou seletivo sólido, líquido ou semi-sólido preparado e distribuído previamente em placas de Petri ou tubos. - As diluições são distribuídas por pipetas estéreis, com volumes de 0,1 a 0,5 mL na superfície do gel já solidificado, e espalha com movimentos cuidadosos com bastão de vidro em L ou alça de Drigalski. Incubar as placas invertidas. - Esta metodologia não se aplica a amostras com carga microbiana inferior a 2 UFC/g (mL).

Semeadura da amostra em superfície Meio líquido Meio sólido inclinado Meio semi-sólido Meio sólido placa de Petri

Membrana Filtrante Análise quantitativa. - Alíquotas do produto ou suas diluições – filtradas em membranas apropriadas. - Membranas de 0,45μm ou 0,20 μm de poro e 47 mm de diâmetro. - Coloca-se a membrana sobre placa contendo meio de cultura solidificado. - Permite amostragem de volumes elevados.

Membrana Filtrante Sterifil aseptic Suporte de filtração a vácuo Sterifil em polissulfona, composto de funil, base e copo coletor. Stericup Unidade filtrante STERICUP com membrana express 0,22mm e PVDF 0,45 um, funil e frasco coletor. Trasnferir a membrana para placa de Petri e incubar

INCUBAÇÃO DAS AMOSTRAS - Colocar placas em estufa a 30-35° C por 2 a 5 dias na posição invertida, ou estante com tubos, para verificar a presença de bactérias. - Colocar placas em estufa a 20-25° C por 5 a 7 dias na posição invertida, ou estante com tubos, para verificar a presença de fungos e leveduras. Contagem: à vista desarmada ou com auxílio de contadores. Transcorrido o tempo de incubação, considerar a contagem, somente das placas da mesma diluição que apresentarem de 30-300 colônias. Multiplica-se a média das mesmas pelo respectivo fator de diluição e se expressa o resultado em UFC/g de amostra.

Número Mais Provável (NMP) Análise estimativa fundamentada em probabilidade. - Indica o valor dentro de uma faixa que reflete o número de organismos presentes. Embora apresentando imprecisão maior – é oficilamente recomendado. - Melhor revitalização de microrganismos estressados –perfeito contato com o meio de cultura. Recomendado para amostras pouco solúveis e translúcidas. - Permite amostras com níveis elevados de concentração, mas é indicado para quando se espera valores baixos de contagem- caldo de dupla concentração

Número Mais Provável (NMP) - Emprega meios líquidos – diluições seriadas das amostras inoculadas nos mesmos. - Uso de tabelas estatísticas. - Número de réplicas de cada diluição pode variar - o mais comum : 3 ou 5 réplicas. As tabelas oferecem o número mais provável de microrganismos por mL ou g e os limites inferior e superior (limite de confiança de 95%) Leitura e obtenção dos resultados se dá por comparação com padrão de turvação de meios de cultura não seletivos.

Para a escolha da tabela na qual se verificará o NMP correspondente à combinação de tubos positivos, atentar para a quantidade (g ou mL) de amostra que foi realmente inoculada em cada tubo das diferentes séries e não o volume inoculado. Quantidade de amostra inoculada em cada série Inoculação de 1,0 mL da diluição 10-1 na 1ª série 0,1 g ou mL 1,0 mL da diluição 10-2 na 2ª série 0,01 g ou mL 1,0 mL da diluição 10-3 na 3ª série 0,001 g ou mL Quando inoculamos mais de 3 diluições seriadas, selecionar a maior diluição na qual todos os tubos inoculados são positivos e considerar as 2 diluições seguintes maiores que a selecionada.

Exemplo 1: Amostra de medicamento líquido que foi inoculada nas diluições abaixo e apresentaram os seguintes resultados: 10-2 3 tubos positivos 10-3 2 tubos positivos 10-4 0 tubos positivos O valor de NMP a ser lido na tabela correspondente seria 3/2/0, que corresponde ao valor 93 NMP/g ou mL. Como, neste caso a amostra estava diluída a 10-2, o resultado obtido na tabela deve ser multiplicado por 100 para a obtenção do valor do NMP real por grama ou mL do alimento em análise. Assim, o resultado final será: 9300 NMP/g ou mL.

EXERCÍCIO. Uma amostra de fitoterápico (cavalinha em pó) foi submetido à contagem microbiana pela técnica de semeadura em superfície, onde uma alíquota de 10 g foi pesada e homogeneizada com 90 ml qsp de diluente biocompatível contendo polissorbato. A seguir, foram feitas diluições seriadas na razão de 1:10 até a diluição 10-3 (alíquotas de 1mL em 9mL de diluente). A seguir, cada diluição foi plaqueada em meio de cultura TSA fundido (em triplicata), seguindo-se a incubação das placas inoculadas. Baseado no exposto acima, pergunta-se: Qual foi a quantidade de amostra dispensada na triplicata de placas correspondente à diluição 10-2 ?