Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) Greice Andreotti De Molfetta, PhD

SAGE Vantagens: Sistema aberto – todos os transcritos podem ser identificados; Acuracia na detecção dos transcritos; Banco de dados digital; Informação quantitativa e qualitativa; Desvantagens: Caracterização de novos transcritos é computacionalmente complicada a partir de sequencias pequenas (tags); Especificidade da Tag (aumentou para 21 bp); Existência de transcritos que não contem o sítio da enzima NlaIII; Sensitividade baixa da detecçao de variantes de splicing alternativo;

TAGS TAGS ou ETIQUETAS: Seqüências pequenas mas exclusivas de um determinado gene. NÃO SE REPETEM EM OUTROS GENES 10 pares de bases Banco de dados grande e validado AAAAAAAAA CATG

TAGS TAGS de 10 pb - identificam unicamente um transcrito; TAGS ligados uns aos outros facilitam clonagem e seqüenciamento de todos os transcritos da amostra; Análise: os tags são separados e identificados através de seus sítios de reconhecimento CATG; Velculescu et al, 1995

SAGE e Tags Baseando-se na existência das tags e na sua identificação: Análise em série ( Grande escala): Identificação de um número maior de genes Transcriptoma completo de um organismo Custo e tempo menores Quantificação da expressão gênica (contagem dos tags)

DITAGS Localizado entre as sequências “CATG” Ditags apresentam 20-26 pb entre cada sequencia “CATG” Descartar os ditags duplicados - incluindo aqueles da fita reversa da PCR Descartar as sequênicas “linker” Contabilizar a ocorrencia de cada tag

Como é um resultado de SAGE?

SAGE 1- Obtenção do RNAm (poli-A); 2- Síntese do cDNA com o uso de oligo (dt) biotinilado; 3- Ligação do cDNA (cauda poliA) à partículas magnéticas revestidas com Streptavidina; 4- Clivagem com uma enzima de ancoragem (NlaIII) que reconheça 4 pb (CATG); 5- Ligação de adaptadores (contendo um sítio de reconhecimento para a enzima de etiquetagem, e sítios para os primers A e B) aos cDNAs; 6- Clivagem com a enzima de etiquetagem (TE) (BsmF1), uma enzima do tipo 2 que reconhece o sítio do Adaptador (adjacente ao cDNA) clivando aproximadamente 14 pares de bases adiante, liberando um tag específico para o cDNA; 7- Ligação dos tags para formação de ditags; 8- Amplificação dos ditags por PCR com os primers A e B; 9- Isolamento dos ditags utilizando a enzima de ancoragem para retirada dos adaptadores; 10- Recuperação dos ditags; 11- Formação dos concatâmeros pela ligação dos ditags; 12- Clonagem e seqüenciamento dos concatâmeros, que formam a biblioteca de SAGE.

SAGE Esquema da abordagem experimental adotada pela técnica de SAGE (figura obtida do protocolo original, disponível em www.sagenet.org).

SAGE Extração RNA : 1 2 3 28 S 18 S 4 S

SAGE Síntese da dupla fita. A) Representação esquemática da síntese da dupla fita de cDNA; B) RT-PCR: linhas 1 e 2 são amplificações com, GAPD da amostra linhagem granulocítica (1) e amostra da linhagem ertitrocitária (2); linhas 3 e 4 são amplificações com EEF1A1 da amostra linhagem granulocítica (3) e amostra da linhagem eritrocitária.

SAGE Digestão com a enzima Nla III. Representação esquemática da digestão em seguida da captura da região de interesse. B) PCR usando “primers” específicos para GAPDH (linha 2) e EEF1A1 (linha 4). Após a digestão, um sítio de ligação do primer GAPDH é perdido (linha 3), enquanto os sítios para EEF1A1 continuam intactos (linha 5).

SAGE Ligação do adaptador nos “pools” A (linhagem granulocítica) e B (linhagem eritróide). A) representação esquemática da ligação. B) PCR usando “primers” específicos de cada adaptador e para o gene EEF1A1. As linhas 1 e 3 correspondem ao produto de PCR com o conjunto de “primers” correto, DTP-1 com o “pool” A e DTP-2 com o “pool” B. As linhas 2 e 4 correspondem ao produto de PCR com o conjunto de “primers” trocados

SAGE Formação dos “tags”. A) representação esquemática da clivagem com BsmFI. B) Produto da amplificação para verificar a eficiência da digestão. Linhas 1 e 3, e linhas 2 e 4 representam amplificação do “pool” A e B antes e depois da digestão, respectivamente.

SAGE Ligação e expansão dos “ditags”. A) Representação esquemática. B) Amplificação dos “ditags” nas diluições 1:20 (1), 1:40 (2), 1:80 (3); controle positivo (4), controle negativo sem ligase (5) e branco (6). C) Produtos precipitados da amplificação em grande escala com a diluição 1:120.

SAGE Digestão e purificação dos “ditags”. A) Representação esquemática da digestão com NlaIII para liberação dos “ditags”. B) Gel de poliacrilamida com os fragmentos resultantes da digestão enzimática. O fragmento de 26 pb foi purificado para a formação dos concatâmeros.

SAGE Ligação dos “ditags” e formação dos concatâmeros. A) Representação esquemática. B) Gel de poliacrilamida com o perfil de fragmentos de concatâmeros; o marcador é utilizado para orientar no isolamento dos fragmentos a serem clonados.

SAGE

SAGE total de tags sequenciadas: 60.000 10.633 2.191 9.230 2.040 2.224 Est. Vermelho Normal Est. Branco 10.633 2.191 9.230 2.040 2.224 15.809 4.234

Genes + expressos estímulo branco