Birth of parthenogenetic mice that can develop to adulthood Tomohiro Kono, Yayoi Obata, Quiong Wu, Katsutoshi Niwa, Yukiko Ono, Yuji Yamamoto, Eun Sung Park, Jeong-Sun Seo & Hidehiko Ogawa Nature - vol 428 – 22 april 2004

Porque não ocorre partenogênese em mamíferos? IMPRINTING

Expressão Gênica Diferencial Função de cada um Embrião Somente com cromossomos maternos: Tecidos extraembrionários se desenvolvem pouco Somente com cromossomos paternos: Desenvolvimento do embrião é retardado Expressão Gênica Diferencial

Genes Igf2 e H19 Cópia materna - expressa H19 Cópia paterna - expressa Igf2 DMD: differentially methylated domain Está entre os dois genes, acima do gene H19 Coopera com acentuadores abaixo do gene H19 Cópia materna: CTCF se liga a DMD Cópia paterna: DMD metilado – ligação impedida

Kono e colaboradores Cromossomos de óvulo imaturo (ngWT) sem imprintings Cromossomos de óvulo maduro (fgWT) Embriões partenogenéticos (13,5 dias de feto) Não desenvolvido – camundongos recém nascidos Desenvolvidos – camundongos adultos

Partenogênese X Genes H19 e Igf2 Cromossomos de óvulo imaturo (ngH19Δ3) sem uma região de 3Kb (gene H19) Cromossomos de óvulo maduro (fgWT) Embriões partenogenéticos (17,5 dias de gestação) Não desenvolvido – camundongos recém nascidos Desenvolvidos – camundongos adultos

Partenogênese X Genes H19 e Igf2 + DMD Cromossomos de óvulo imaturo(ngH19Δ13) sem região do gene H19 e do DMD Cromossomos de óvulo maduro (fgWT) Não desenvolvido – camundongos recém nascidos Desenvolvidos – camundongos adultos

Table 1 Development of reconstructed parthenogenetic embryos Developmental progress Number Number of reconstructed eggs 457 Number of embryos developed to Blastocysts 417 (91.2% of reconstructed eggs) Number of embryos transferred 371 (89.0% of blastocysts) Number pregnants/recipients 24/26 Number of implantation to recipients 246 (71.7% of embryos transferred to pregnants) Number of pups 28 (8.2% of embryos transferred to pregnants) Dead 18 (5.2% of embryos transferred to pregnants) Live 8 (2.3% of embryos transferred to pregnants) Survived 2 (0.6% of embryos transferred to pregnants)

Análise de expressão gênica global Microarray de embriões com 12,5 dias de gestação Controle, ngWT/fgWT e ngH19Δ13/fgWT Fenótipos similares com o controle mas pesos da placenta e do feto inferior aos do controles Não houve diferença significativa na proporção de embriões gWT/fgWT (25%) e ngH19Δ13/fgWT (35%).

Análise de expressão gênica global O padrão de expressão gênica dos embriões ngH19Δ13/fgWT diferiu em uma grande variedade de genes quando comparados com embriões ngWT/fgWT. Foram 1038 genes distribuídos: 15,1% comunicação celular 19,1% manutenção/crescimento celular 21,9% metabolismo

Dentre os 34 genes com imprinting: ngH19Δ13/fgWT Grb10 (mantém comportamento de FmFm, 2 cópias ligadas) Upregulated mais do que o dobro dos níveis de controle. Nnat (FmFm, tem 2 cópias desligadas) Downregulated menos que a metade dos níveis de controle. ngWT/fgWT 11 genes são downregulated (FmFm, 2 cópias desligadas) Grb10 é upregulated no ngWT/fgWT (FmFm, ligados) Os dados mostram claramente que a normalização marcada de expressão de uma grande variedade de genes ocorridos no ngH19Δ13/fgWT e mais parceiros fisicológicos de expressão gênica suprem o desenvolvimento suficente competente por esses embriões

Expressão diferencial significativa Entre 11 e 42 (média 30) genes nos ngH19Δ13/fgWT Somente o gene Dlk1 mudou sua expressão nos 4 embriões ngH19Δ13/fgWT Entre 431 e 1324 (média 842) genes ngWT/fgWT 329 genes com expressão diferenciadas nesses embriões (todos eles)

Quais genes seriam responsáveis pela sobrevivência dos embriões partenogenéticos? Igf2 H19 Passam a ter imprinting Dlk1 durante a espermatogênese Gtl2 Análise de expressão gênica quantitativa : Real time PCR

H19 mesmo nível em ngH19Δ13/fgWT Dlk1 (pulmões, coração e músculo) Resultados Igf2 Expressos no H19 mesmo nível em ngH19Δ13/fgWT Dlk1 (pulmões, coração e músculo) ngH19Δ13/fgWT somente no músculo e pulmões (coração OK...) Nos embriões com crescimento retardado a expressão no pulmão foi reprimida também = causa da morte? Gtl2 Em embriões com crescimento retardado tiveram níveis de expressão 2 a 4 vezes maiores que o controle Normalmente tem expressão bilateral (dados recentes) Diminuição da expressão de Gtl2 e ativação de Dlk1 pode ser uma das causas do desenvolvimento normal de embriões partenogenéticos sobreviventes. Os dois genes devem ter tido expressão normal nos partenotos que sobreviveram

Conclusão Imprinting é uma barreira para desenvolvimento partenogenético em camundongos Hipótese do conflito parental Expressão apropriada de Igf2 e H19 causa modificação em uma grande variedade de genes e no desenvolvimento normal em camundongos partenogenéticos ngH19Δ13/fgWT.