MÉTODOS PARA QUANTIFICAR OS MICRORGANISMOS MEDIDA DO CRESCIMENTO MÉTODOS PARA QUANTIFICAR OS MICRORGANISMOS

Etapa fundamental: diluição (para fungos filamentosos se aplica a esporos) Fator de diluição = volume da amostra/volume total 1 mL em 9 mL ==> diluição 1:10 ou 1/10 ou 10-1 Diluição seriada: consiste em diluir sucessivamente a diluição inicial. Esquema: 1) Contagem do nº total de células (vivas e mortas) - câmara de contagem (matar ou impedir movimento) - coulter-counter (alteração de resistência) - contagem em esfregaços corados (0,01 mL) - turbidimetria (comparação visual com solução de sulfato de bário – escala de Mc Farland

2) Contagem do número de microrganismos vivos Baseado no conceito de que a viabilidade é o poder de formar colônias macroscópicas em meio de cultura sólido ou de tornar turvo um meio de cultura líquido ==> item fundamental: meio de cultura. - contagem do nº de colônias na superfície do meio (entre 30 e 300 colônias) - contagem do nº de colônias “pour plate” (entre 30 e 300 colônias) - contagem do nº de colônias após inoculação com gotas (até 15 colônias) (esquema) - contagem do número de colônias após filtração - método do Número Mais Provável (N.M.P) (turvação meio líquido) (tabela)

- método do Número Mais Provável Alternativo (N. M. P. A - método do Número Mais Provável Alternativo (N.M.P.A.) (colônias visíveis em meio sólido) (tabelas) 3) Medida da biomassa (vivos e mortos) - determinação da massa celular secagem do filtro contendo células secagem da suspensão de células multiplicar pela diluição, se houver. -turbidimetria com espectrofotômetro Obtenção de curva padrão de células (massa seca) - Dosagem de componentes celulares (nitrogênio e proteínas, ergosterol, glicosamina) - Dosagem de compostos resultantes da atividade metabólica (CO2, O2, ácidos, etc.) -Medida de volume de material celular após centrifugação.

EXERCÍCIOS 1) Uma amostra de uma suspensão de esporos diluída (1:4) foi colocada em câmara de Neubauer de 400 quadrados (1/400 mm2 e 0,1 mm), e procedeu-se à contagem de cinco campos de 16 quadrados. Os resultados encontrados foram: Primeira contagem Segunda contagem Campo No de esporos Campo No de esporos A 78 A 92 B 73 B 82 C 83 C 60 D 71 D 69 E 71 E 63 Qual a diluição que deve ser feita para que esta suspensão apresente 2x107 esporos/mL?

2) Uma cultura de levedura foi diluída sequencialmente, conforme o esquema a seguir: 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL  9,0 mL  9,0 mL  9,0 mL amostra sol. salina sol. salina sol. salina PL1 PL2 PL3 100 µL de cada diluição foram inoculados em placa de Petri (PL) contendo ágar para contagem de células viáveis pela técnica de pour plate. Após incubação obtiveram-se as seguintes contagens de colônias: PL1 – 252 UFC PL2 – 32 UFC PL3 – 13 UFC. Calcule a concentração de células viáveis (por mL) da amostra.

Equação da reta: Y= 0,0266 + 2,1135.X Diluição Abs 1:10 0,286 1:9 3) Foram feitas duas diluições de uma amostra de suspensão de bactérias: 1:10 e 1:50. As diluições foram submetidas a leitura da absorbância, obtendo-se os valores 0,206 e 0,705. Os dados usados para obter a curva padrão de massa seca e a respectiva equação da reta estão apresentados abaixo. Calcule o volume da suspensão necessário para inocular 1,2 L de meio de forma que sua concentração celular seja igual a 1,0 g/L. Diluição Abs 1:10 0,286 1:9 0,316 1:8 0,345 1:7 0,400 1:6 0,460 1:5 0,550 1:4 0,688 1:3 0,891 1:2 1,275 Equação da reta: Y= 0,0266 + 2,1135.X