A BIOQUÍMICA ESTRUTURAL para as CIÊNCIAS da SAÚDE

Capítulo III. A Cinética Enzimática Enzimas ?

Enzimas ? ? Catalisadores biológicos Poder catalítico e especificidade Reguladas Nem todas as enzimas são proteínas Ribozimas... ?

As enzimas podem aumentar a velocidade das reacções pelo menos 1 milhão de vezes... COMO ?

PROTEÍNAS - Enzimas: cofactores Muitas enzimas (APOENZIMAS) necessitam de cofactores - Metais

…Metais Enzimas: cofactores Anidrase carbónica humana: requer zinco, que está ligado aos anéis imidazol de 3 resíduos de histidina e a uma molécula de água

Enzimas: cofactores Muitas enzimas (APOENZIMAS) necessitam de Pequenas moléculas orgânicas - COENZIMAS

Enzimas: cofactores … Pequenas moléculas orgânicas (coenzimas) Fosforilase do glicogénio: envolvida na utilização de glicogénio para produzir energia, requer a coenzima piridoxal fosfato (PLP)

Enzimas: cofactores COFACTORES Iões Metálicos Coenzimas Iões Activadores Iões do local activo Cosubstratos Grupos prostéticos

Enzimas: classificação

Catálise Enzimática ... As interacções com o substrato, envolvem: Enzimas: funcionamento Catálise Enzimática Depende de interacções precisas com o substrato... ... As interacções com o substrato, envolvem: forças de van der Waals forças electrostáticas pontes de hidrogénio interacções hidrofóbicas

Especificidade - Definida pela estrutura 3D (ou 4D) Enzimas: especificidade Especificidade - Definida pela estrutura 3D (ou 4D)

Enzimas: funcionamento As enzimas não conseguem alterar as leis da termodinâmica → não alteram o equilíbrio de uma reacção química A + B AB Uma enzima acelera os dois sentidos da reacção exactamente na mesma proporção

E + P ES E + S Enzimas: funcionamento Formação de um complexo que representa o estado de transição... E + P      ES E + S

Enzimas: funcionamento

Enzimas: funcionamento Facilitam a ocorrência do estado de transição, diminuindo a energia de activação, e consequentemente, aumentando a velocidade da reacção

O estado de transição existe? Enzimas: funcionamento O estado de transição existe? Para uma concentração constante de enzima, a velocidade da reacção aumenta com o aumento da concentração do substrato, até se atingir uma velocidade máxima... ... todos os centros catalíticos estão preenchidos e, consequentemente, a velocidade da reacção …

O estado de transição existe? Enzimas: funcionamento O estado de transição existe? Alterações nas características espectroscópicas de enzimas quando se adiciona substrato - complexo enzima substrato. A intensidade da fluorescência da sintetase do triptofano varia com a adição de serina e de indol (substratos)

Resolução de estruturas por cristalografia de raios-X Enzimas: local activo Local Activo Resolução de estruturas por cristalografia de raios-X

Enzimas: local activo Lisosima

O local activo da Cardosina A A resolução da estrutura 3D trouxe importante informação sobre o local activo permitindo esclarecer a especificidade desta enzima. - São conhecidas nas PAs as suas restrições em termos de especificidade secundária. Os resíduos adjacentes aos resíduos da ligação a ser cortada também desempenham papel importante, na hidrólise da ligação peptídica a ser clivada. Só aceita nos diferentes sub-locais determinados resíduos de aas. - Ou seja o estudo de especificidade da cardosina A como PAs que é, só fica completo quando se conhece a sua especificidade secundária. - Esquema explicar esq. - Péptido da k-caseina, com a ligação clivada pela cardosina A, Phe105 - Met106, que dá inicio ao processo de coagulação do leite. - Resíduos que estão a 4.0 Å do fragmento de K-caseína. - Vemos pelo nº de resíduos que estão envolvidos que o local activo é feito por uma rede intrincada de interacções, que contribuirão com certeza para a integridade da actividade da enzima que ocorre numa ampla gama de pH que vai de 2-7.5. Contribuirão para a estabilidade do estado de transição e permitirão as interacções efectivas durante as alterações conformações necessárias à catálise.  8-10 aminoácidos no local activo  Preferência por resíduos hidrofóbicos Nomenclatura dos aminoácidos no local activo P3-P2-P1 – P`1-P`2-P´3

Asp catalíticos Protease aspártica

ESTRUTURA da Cardosina A A estrutura primária obtida por sequênciação da proteína isolada, revelou a grande homologia que esta enzima tinha com a pepsina, que pertence à família A1 e ao clã AA é considerada a PAs arquétipo. Hoje é possível aceder a bancos de dados, introduzir a nossa sequência e obter a possível estrutura secundária da enzima. Bem, mas em relação à cardosina A vemos que se trata de uma enzima com estrutura rica em folhas beta, em ambas as subunidades. - Quer a subunidade maior, quer a menor possuem cerca de 46% da sua estrutura constituída por folhas beta e apenas 10% são hélices alfa. Curiosamente cerca de 40% estão dedicados a elementos sem conformação definida. Estará o sucesso da grande estabilidade desta enzima? Vemos a sequência conservada que rodeia os Asp catalíticos: DTG e DSG. Os aas conservados Tyr75 e Thr77, envolvidos no loop que fecha o local activo. Os locais de glicosilação Asn67 e Asn257 A estrutura é estabilizada por 3 pontes S-S. 2 na sub-unidade maior e 1 na menor. 2 sequências de adesão que mais tarde se verá como são importantes em mecanismos de interacção com outras moléculas. Uma em cada cadeia.

S`1 S3 S1 S`2 S`1 S2 S`3 Cardosina A

Pepsina Cardosina A

Gly76 S2 na cardosina e pepsina

Enzimas: local activo

...a enzima ajusta-se à molécula do substrato na sua presença. Enzimas: local activo Modelo do encaixe induzido ...a enzima ajusta-se à molécula do substrato na sua presença.

...a enzima ajusta-se à molécula do substrato na sua presença. Enzimas: local activo ...a enzima ajusta-se à molécula do substrato na sua presença.

O que se passa no local activo? Enzimas: local activo O que se passa no local activo?

Para promover interacções efectivas com o substrato Enzimas: local activo Para promover interacções efectivas com o substrato Ribulose-1,5-bifosfato

Definida pela estrutura 3D (ou 4D) Enzimas: especificidade Definida pela estrutura 3D (ou 4D)

Enzimas: Cinética Enzimática Modelo de Michaelis e Menten

Enzimas: Cinética Enzimática Modelo de Michaelis e Menten V, varia com a [S] para uma concentração fixa de enzima [E0]

Enzimas: Cinética Enzimática

KM é uma medida da afinidade da enzima para o substrato Enzimas: Cinética Enzimática ... Em geral, KM estão compreendidos entre 10-2 M e 10-8 M KM é uma medida da afinidade da enzima para o substrato

Enzimas: Cinética Enzimática ... Em geral, KM estão compreendidos entre 10-2 M e 10-8 M Kcat - “turnover number”

Enzimas: Cinética Enzimática Como medir a eficiência de uma enzima? ...usando a razão Kcat/KM (Kcat –velocidade de catálise máxima) Perfeição enzimática Algumas enzimas aproximam-se destes valores...

Enzimas: Cinética Enzimática Estas enzimas são limitadas apenas pela velocidade com que encontram o substrato em solução

Enzimas: Cinética Enzimática Influência da temperatura e pH

Enzimas: Cinética Enzimática Influência da temperatura

Enzimas: Cinética Enzimática Influência do pH Os pH extremos modificam irremediavelmente a estrutura das enzimas, quer devido a desnaturação, quer devido a alterações na ligação entre apoenzima e coenzima

Enzimas: Cinética Enzimática Influência do pH – Regula a actividade

Enzimas: Cinética Enzimática Substratos múltiplos Reacções com transferência de grupos funcionais de um substrato para o outro... ...nas reacções de oxidação redução, são transferidos electrões Reacções que envolvem substratos múltiplos, classificam-se em duas classes: Deslocamento sequencial Deslocamento duplo

Enzimas: Cinética Enzimática Substratos múltiplos Deslocamento sequencial Todos os substratos têm que estar ligados antes da libertação de qualquer produto Dividem-se em duas subclasses: Sequencial ordenado Sequencial aleatório

Enzimas: Cinética Enzimática Enzimas: Substratos múltiplos Deslocamento sequencial Deslocamento duplo

Forma-se um complexo ternário Enzimas: Cinética Enzimática Substratos múltiplos Deslocamento sequencial Num mecanismo sequencial ordenado, a ordem de ligação do substrato e de libertação do produto é importante Forma-se um complexo ternário

Enzimas: Cinética Enzimática Enzimas: Substratos múltiplos Deslocamento sequencial Num mecanismo sequencial aleatório, a ordem de ligação do substrato e de libertação do produto não é importante

Enzimas: Cinética Enzimática Substratos múltiplos Deslocamento duplo Também designadas de reacções “ping pong” Um dos produtos é libertado antes de todos os substratos estarem ligados Neste tipo de reacções, forma-se um complexo enzima - substituída Um grupo funcional é transferido do primeiro substrato para a enzima O primeiro produto é libertado Liga-se o segundo substrato e o grupo funcional ligado à enzima é transferido para ele

Substratos múltiplos Deslocamento duplo Enzimas: Cinética Enzimática Substratos múltiplos Deslocamento duplo Catalisa a transferência de um grupo amina do aspartato para o -Cetoglutarato

Deslocamento sequencial Enzimas: Cinética Enzimática Deslocamento sequencial ordenado Deslocamento duplo ?

Regulação e Inibidores Enzimas: Cinética Enzimática Regulação e Inibidores A actividade de diversas enzimas pode ser inibida pela ligação de pequenas moléculas específicas e de iões Algumas drogas e agentes tóxicos podem inibir o funcionamento de certas enzimas A inibição pode ser reversível ou irreversível

Regulação e Inibidores Enzimas: Cinética Enzimática Regulação e Inibidores Inibição reversível O complexo enzima – inibidor dissocia-se rapidamente Dois tipos de inibição: Competitiva Não competitiva

Regulação e Inibidores Inibição reversível: Competitiva Enzimas: Cinética Enzimática Regulação e Inibidores Inibição reversível: Competitiva

Regulação e Inibidores Inibição reversível: Não - Competitiva Enzimas: Cinética Enzimática Regulação e Inibidores Inibição reversível: Não - Competitiva

Regulação e Inibidores Enzimas: Cinética Enzimática Regulação e Inibidores Inibição reversível

Regulação e Inibidores Inibição reversível: Mista Enzimas: Cinética Enzimática Regulação e Inibidores Inibição reversível: Mista

Quimosina+Pepstatina Inibidor Gly76 Quimosina+Pepstatina Inibidor Gly76 C-terminal Loop flexível

Regulação e Inibidores Inibição irreversível Enzimas: Cinética Enzimática Regulação e Inibidores Inibição irreversível Os inibidores irreversíveis ligam-se covalentemente aos resíduos dos locais activos Desenho Racional de Fármacos ?

Quimosina Inibidor

Regulação e Inibidores Inibição irreversível Enzimas: Cinética Enzimática Regulação e Inibidores Inibição irreversível Existem três classe de inibidores irreversíveis: Específicos de grupos Proteases tiólicas Ligam-se a cadeias laterais específicas

Regulação e Inibidores Inibição irreversível Enzimas: Cinética Enzimática Regulação e Inibidores Inibição irreversível Marcadores de afinidade Moléculas estruturalmente semelhantes ao substrato e que modificam covalentemente o local activo Mais selectivos que os específicos de grupos O TPCK é um marcador de afinidade para a quimotripsina – DIAGNÓSTICO?

Regulação e Inibidores Inibição irreversível Enzimas: Cinética Enzimática Regulação e Inibidores Inibição irreversível Inibidores suicidas São substratos modificados e são os mais específicos para marcar o local activo Ligam-se como se fossem substrato e o mecanismo catalítico normal é activado, produzindo uma espécie reactiva que posteriormente se liga covalentemente à enzima

INIBIDOR ? Regulação e Inibidores Enzimas: Cinética Enzimática Regulação e Inibidores INIBIDOR ? Desenho Racional de Fármacos - Inibidores para o estado de transição

? Regulação e Inibidores Biblioteca de péptidos Enzimas: Cinética Enzimática Regulação e Inibidores Desenho Racional de Fármacos - Inibidores para o estado de transição ? Moléculas que imitam o estado de transição do substrato, são inibidores potentes Biblioteca de péptidos

? Como são feitos os estudos? PROPOSTA PELOS ALUNOS Enzimas: Cinética Enzimática Regulação e Inibidores ? Desenho Racional de Fármacos - Inibidores para o estado de transição Como são feitos os estudos? PROPOSTA PELOS ALUNOS