Atividade da água – Aw Potencial hídrico – Ψ Pressão osmótica pH Fatores abióticos Atividade da água – Aw Potencial hídrico – Ψ Pressão osmótica pH

(indústria de alimentos, farmacêutica) Atividade de água (Aw) (indústria de alimentos, farmacêutica) Indica o nível de água em sua forma livre nos materiais. Os microrganismos aproveitam somente a água livre, que difere dependendo do material. É definida pela diminuição da pressão parcial do vapor de água: Aw = P/P0 P = pressão de vapor da água no material P0 = pressão de vapor da água pura A diminuição da atividade é devido à imobilização da água pelos constituintes químicos presentes no material, que diminuem sua capacidade de vaporizar-se.

Sem água não existe atividade microbiana Aw (Activity of water) Expressa a quantidade de água disponível para atividade microbiana. Esta água livre está disponível para participar das reações químicas que influenciam: -Nas características e qualidade dos produtos (durabilidade, estabilidade) produtos farmacêuticos, alimentos e de higiene pessoal. Sem água não existe atividade microbiana

Aw e o conteúdo de água do material Conteúdo de água de um substrato mede água total, por outro lado, Aw prevê melhor a capacidade de crescimento microbiano porque mede água disponível. A disponibilidade depende do tipo de soluto. Em concentrações semelhantes o sal baixa mais a Aw do que o açúcar Íons baixam Aw mais do que polímeros

Aw depende dos solutos presentes Exemplos: Aw depende dos solutos presentes Margarina contém principalmente lipídios hidrofóbicos frutas contém açúcares hidrofílicos Umidade (peso fresco) 20% Aw 0,9 0,6 Margarina Frutas secas Pontos de ebulição Solução de açúcar PE > 100˚C Aw < 1 Lipídio/água (2 fases) PE = 100˚C Aw = 1

Aw A água disponível varia consideravelmente dependendo do soluto: Polímeros Gorduras Açúcares Sal Íons.

Solutos para reduzir Aw - álcoois - açúcares (sorbitol, frutose de milho) - sais de cálcio e sódio - glicerina - emulsificantes (goma xantana) - proteínas Química da redução de Aw Ligações da água com: grupos de hidroxilas dos açúcares; grupo amina e carbonila das proteínas; pontes de hidrogênio; forças dipolo-dipolo; forças de Van der Waals; ligações iônicas.

Como se calcula Aw? Colocar amostras de 2 g do material em frascos fechados com atmosferas de diferentes umidades relativas constantes, obtidas através de soluções saturadas de sais em frascos colocados em estufa a 25 C. Depois de 4 horas pesar as amostras para obter a variação de umidade. Com os dados construir um gráfico com os ganhos e perdas de umidade contra a umidade relativa correspondente a cada solução salina. Através de regressão linear, determinar a atividade de água, correspondendo ao ponto onde a amostra não ganha nem perde peso (Landrock e Proctor, 1951). No equilíbrio existe igualdade entre a atividade de água e a pressão parcial relativa do vapor de água do material, ou seja, Aw = UR/100 = Xw. UR = umidade relativa do ar Xw = teor de umidade Sais UR (%) 25 C 35 C Hidróxido de potássio (KOH) 8 6 Acetato de potássio (KCH3CO2) 23 Carbonato de potássio (K2CO3.2H2O) 43 41 Nitrito de sódio (NaNO2) 65 62 Cloreto de sódio (NaCl) 75 Sulfato de amônio ((NH4)2SO4) 79 Cloreto de potássio (KCl) 86 84 Sulfato de potássio (K2SO4) 97 96 Relação de sais e suas respectivas umidades relativas

Atividade de água Ex.: Resultado do ensaio onde se obteve um valor de Aw=0,985 para um composto a base de cascas de pínus utilizada para plantio de mudas. Comentário: A atividade de água é considerada alta, pois no caso de contaminação do composto pode haver o desenvolvimento de bactérias, já que é possível seu crescimento a partir de 0,85. O composto para esta aplicação é bioestabilizado, entretanto a adição do fungo introduz nutrientes a partir das células mortas, que podem favorecer o crescimento de microrganismos saprófitos, e inviabilizar o inoculante. Variação da umidade em função da umidade relativa (UR = Aw) para o composto agrícola Mecplant Floresta 1.

Aqualab para medir Aw

Isoterma de adsorção e dessorção mostrando a histerese Relação entre Aw e conteúdo de água Relação complexa – as isotermas de adsorção (ou dessorção) Aumento de Aw quase sempre implica em aumento de conteúdo de água mas não de forma linear e dependente da temperatura. Curvas de relação são geralmente sigmoidais. Uma isoterma é uma curva que indica, no equilíbrio e para uma certa temperatura, a quantidade de água retida por um material em função da umidade relativa da sua atmosfera. As isotermas podem ser obtidas colocando-se amostras do material (seco ou úmido) em uma série de recipientes fechados, nos quais se mantém diferentes umidades relativas constantes e medindo-se, depois do estabelecimento do equilíbrio, os conteúdos de água por pesagem. Isoterma de adsorção e dessorção mostrando a histerese

Crescimento microbiano e Aw A maioria dos microrganismos vivem em Aw de 1,00 a 0,70 A Aw é muito importante na área de alimentos, pois: define a quantidade e os tipos de microrganismos presentes.

Aw Produtos Afetados Grupo Microbiano Exemplo 1,0 água pura Bactérias Comuns Spirillum 0,995 sangue Streptococcus, Escherichia 0,980 água do mar Psudomonas, vibrio 0,950 pão Bacilos Gram + 0,900 presunto Leveduras comuns Cocos Gram + 0,850 salame Fungos Comuns Saccharomyces rouxii 0,800 bolos, geléias Saccharomyces bailli, Penicillium 0,750 peixe salgado, mel Halofílicas Halobacterium, Halococcus 0,700 cereais, balas Xerofílicas Fungos xerofílicos 0,600 frutas secas Leveduras osmofílicas Saccharomyces bisporus

Aw para crescimento: Maioria dos microrganismos Aw > 0,90 Bactérias patogênicas 0,85 < Aw < 0,60 Xerofílicos, Osmofílicos, Halofílicos 0,70 < Aw < 0,75

Aw e deterioração dos alimentos Quando aw , deterioração  Produtos reativos mais móveis Água mais disponível como reagente (ex: hidrólise) Água mais disponível para crescimento microbiano Em Aw elevada reações podem diminuir Reativos estão diluídos

Deterioração alimentos em função de Aw Maillard Reações enzimáticas Hidrólise de lipídeos Velocidade (relativa a aw = 1) microrganismos Lipólise aw

Preservação dos alimentos Aumentar solutos hidrofílicos Diminuir o conteúdo de umidade (desidratação) Congelamento Água sob a forma de gelo, portanto indisponível para reações de degradação AW presunto geléias

2. Ψ (potencial hídrico) (solos) A energia potencial da água, nos vegetais, e no solo, é denominada POTENCIAL HÍDRICO. É a soma de várias forças. Entende-se, portanto, que o potencial de água nesses sistemas vem a ser a diferença existente entre o potencial químico da água no sistema e o potencial químico da água pura, sob as mesmas condições padrões. Água pura livre Ψ=0 então potencial água é um número negativo.

Ψ expressa-se da seguinte forma: (unidades em MPa) y = ma - moa  = R.T. ln (PV/PVo), onde: ma = potencial químico da água em um sistema; moa = potencial químico da água pura; R = constante universal dos gases ideais; T = temperatura absoluta (Kelvin); PV = pressão de vapor da água no sistema (à temperatura T); PVo = pressão de vapor da água pura (à temperatura T). Diversas forças compõem o potencial hídrico, sendo as principais: Potencial osmótico atração dos íons do soluto para a água Potencial matricial adsorção da água as superfícies do solo e forças de capilaridade da água nos poros finos. Potencial gravitacional força da gravidade forçando a água para o centro da Terra.

Tolerância microbiana ao estresse do potencial hídrico matricial Ψm Potencial hídrico (MPa) Atividade da água (Aw) Espessura do filme de água Atividade microbiana limitada a: -0,03 0,999 4,0 μm Movimentação de protozoários, zoósporos e bactérias -0,10 1,5 μm idem -0,50 0,996 0,5 μm -1,5 0,990 3,0 μm Nitrificação;oxidação enxofre -4,0 0,970 <3,0 nm Crescimento bacteriano (Bacillus) -10,0 0,930 <1,5 nm Crescimento fúngico (Fusarium) -40,0 0,750 <0,9 nm Crescimento fúngico (Penicillium)

3. Pressão osmótica (ou potencial) Mudanças na concentração de solutos altera: Disponibilidade da água Pressão osmótica - força resultante de diferenças na concentração de solutos em pontos opostos da membrana

Plasmólise - Redução citoplasma resultante da osmose H2O +++++++ +++++++ H2O Solução hipertônica Solução hipotônica Osmose: Tendência da água se difundir de regiões de baixa concentração de soluto para elevadas concentrações.

Classes osmóticas Não Halofílico (até 0,2 M) Pouca tolerância a salinidade (E. coli) Halotolerante Tolerância moderada a sal (S. aureus) Halofílico ( 3,5 M) Crescimento ótimo (3,5% NaCl) (Vibrio fischeri) Halofílico extremo Crescimento ótimo em elevada salinidade (15-30 % NaCl) Halobacterium salinarum

Moderadamente halofilica Halofílica Halofílicas extremas Halotolerante

Ambientes Halofílicos (superação de radiação e seca) Superando a radiação extrema Salt lake Carotenóides presentes nas células bacterianas Fotoproteção via carotenóides

Até 9x a salinidade do mar

Mono Lake - Califórnia Média atual de 6,9 % de sal

Mecanismos para superar estresses associados 1. Radiação intensa Pigmentos carotenóides fotoproteção-antioxidantes Redução de timinas no DNA alvo da radiação Eficientes mecanismos de reparo do DNA

2. Elevada pressão osmótica = baixo Aw (alimentos secos, lagos salgados, alimentos em salmoura, conservas) Aumentando a concentração interna de sais Bombeando íons do ambiente (estratégia “salt in”) Archaea Sintetizando ou concentrando solutos orgânicos, SOLUTOS COMPATÍVEIS Halobacteria Proteínas com cargas negativas (pI ~4,9) enquanto as proteínas dos não-halofílicos perto da normalidade)

Adaptações Archaea Halofílicas Bombeiam íons Na+ para fora da célula enquanto concentram íons de K+ para dentro da célula para balancear a pressão UV importante para ativar BR (bacteriorodopsina) Cromoproteína relacionada com a síntese de ATP e bomba de prótons

Bactérias halotolerantes e algas Solutos compatíveis solutos absorvidos para manter um estado ligeiramente hipertônico. NÃO DANIFICAM HOSPEDEIRO. (1) Bactérias - colina, potássio, alguns aminoácidos (2) Alga/fungos - sacarose e polióis Ex: Glicerol Dunaliella sp.

Solutos compatíveis Particularmente trealose e sacarose . Em condições de estresse osmótico: primeiro acúmulo de K, seguido de glutamato e depois de trealose. A trealose pode atingir ca de 20 % do peso seco da célula. Solutos compatíveis: se ligam a água presente na célula impedindo-a de sair da célula. formam camadas em torno das proteínas que protegem a água de sair do entorno destas. em baixos níveis de água os solutos substituem a água ligada as proteínas e membranas. Halobacterium spp. chegam a acumular até 5 M KCl dentro das células

Halobacterium salinarium 1.5 M NaCl é requerido para seu crescimento Podem crescer em soluções saturadas de NaCl (6.8 M) Lagoas de evaporação

Importância dos Halofílicos extremos DasSarma, Microbes 1: 120-126, 2006 Halobacterium sp. MODELO PARA ESTUDOS DE ASTROBIOLOGIA RESISTE A DIVERSOS ESTRESSES Radiação extrema Extremos de temperatura Baixos níveis de oxigênio Exposição a metais pesados

4. pH Efeito no crescimento: em nível celular e molecular Os microrganismos e o pH: classes. Extremos e adaptações Aplicações dos extremófilos

pH Acidez do meio é expressa sob a forma de pH Mede o logarítmo da concentração do H+ Microrganismos que são comuns no laboratório crescem a pH 7,0 Streptococcus lactis é típico fermentador do leite

Classes de microrganismos pH Acidófilos Neutrófilos Alcalinófilos Extremófilos

1. Acidófilos: organismos que vivem em pH < 5 Sulfolobus acidocaldarius Cresce a pH 1,0 Extremófilo

2. Alcalinófilos: crescem a pH >10. Natronobacterium gregory Extremófilo pH ótimo = 9,5 Encontrados em lagos e solos alcalinos

Alimentos Maioria dos alimentos dispõe de pH entre 5-7 Bactérias tipicamente não crescem a pH<4,6 pH cresc. nos alimentos Bactérias 5-6 Leveduras 4-4,5 Fungos < 4

Efeito do pH em nível molecular pH extremos afetam o crescimento porque: Desnaturam enzimas Influenciam atividade das proteínas Hidrolizam as proteínas Influenciam na disponibilização dos nutrientes (Ex: CO2)

Desnaturação das proteinas

pH e disponibilização de elementos CO2 CO2 apresenta diferentes formas de acordo com pH: pH Formas pH 4-8 CO2 pH 7-10 Bicarbonato (HCO3- + H) pH >10 Carbonato (Na2 CO3 )

Efeito do pH em nível celular Influencia reações energéticas através de efeito no: Citoplasma Mitocôndria Cloroplasto Membranas

pH e membranas pH influencia nas membranas porque: Excesso prótons Déficit prótons pH e membranas ++++++++++++++++ Influencia a Permeabilidade +++++++++++++++++++ Conservação energia sítio de geração energia e bomba de prótons Influencia a ancoragem das proteínas

Adaptações 1. Maioria dos acidófilos e alcalinófilos mantêm pH interno próximo da neutralidade (usam sistemas de troca de prótons e íons). 2. Sintetizam proteínas que fornecem proteção (proteínas de choque acídico). 3. Produzem ácidos ou bases para neutralizar seu habitat.

Adaptações de Helicobacter pylori Morfologia e outras características H. pylori é uma bactéria em forma de bacilo, espiraralada que tem múltiplos flagelos polares que dão motilidade extraordinária . H. pylori coloniza a mucosa gástrica e é sensível ao suco gástrico (pH ótimo é neutro), mas reside entre o epitélio gástrico e camada mucosa do estômago (ligeiramente alcalino)

H. pylori tem capacidade única de manter pH neutro no espaço periplásmico pela síntese interna de urease. A urease hidroliza uréia que libera amônia e bicarbonato (este excretado pelos pulmões na forma de CO2) Uréia A amônia neutraliza o ácido gástrico que alcaliniza o microhabitat onde a bactéria vive e se multiplica. Amônia + Bicarbonato Urease

Aplicações Acidófilos Biomineração processo de obtenção de minerais por ação de microrganismos.

Biomineração Ex.: Cobre Biolixiviação - Conversão de metais que se encontram na forma sólida para a versão solúvel em água por microrganismos. Ex.: Cobre Bio-oxidação - oxidação microbiológica de minerais que dispõem de um composto de interesse. Sulfato de cobre cobre na forma aquosa Mineração de ouro retirada da pirita-BIOBENEFICIAMENTO Minerais ficam nos resíduos sólidos