MEDICINA LABORATORIAL MICROBIOLOGIA Maria Ana Pessanha -2009

Microbiologia Flora bacteriana – sua importância e composição. Colheitas e transporte de diversos produtos biológicos. Processamento e interpretação clínica.

Flora bacteriana normal Constituída por mais de 200 espécies de bactérias. Depende de factores genéticos, da idade , sexo, stress, estado de nutrição e dieta. A interacção é dinâmica e mutualista: a flora normal recebe do hospedeiro nutrientes num ambiente estável com temperatura constante, protecção e transporte.

Flora bacteriana normal O hospedeiro obtém da flora normal benefícios nutricionais com síntese por ex. de vitaminas K e B12, estimulação da imunidade com produção de anticorpos “naturais” e prevenção da colonização por bactérias patogénicas por produção por ex. de bacteriocinas, que inibem o crescimento de outras espécies.

Flora bacteriana normal A flora está adaptada aos diversos locais do hospedeiro através de ligandos ou adesinas que se ligam a receptores específicos nas células do hospedeiro. A localização preferencial depende do tropismo para determinados tecidos, da especificidade dos receptores e da capacidade de construir ou integrar biofilmes.

S. aureus num cateter vascular

Biofilme - Formação

Biofilme As bactérias que vivem em biofilmes têm propriedades diferentes das que vivem livres no meio ambiente. A protecção permite que elas cooperem e interajam e se tornem resistentes a detergentes e antibióticos. Ao mecanismo de percepção da densidade celular foi chamado “Quorum sensing”. O “QS” permite a comunicação entre as bactérias e coordena as suas actividades a um nível multicelular.

Biofilme De acordo com o CDC os biofilmes são tolerantes aos antimicrobianos e são responsáveis por cerca de 80% de todas as infecções. A tolerância do biofilme é devida à persistência de uma pequena quantidade de bactérias que ficam invulneráveis à acção destes agentes. (Brooun et al, 2000; Spoering and Lewis, 2001)

Quorum Sensing A produção de subtâncias anti-quorum sensing pode ser uma das alternativas, no futuro, para criar alternativas aos antimicrobianos actuais. O bloqueio das comunicações célula-a-célula entre as diversas espécies de bactérias pode prevenir a sua patogenecidade.

COLHEITA DE PRODUTOS BIOLÓGICOS Urina Exsudado vaginal e uretral Infecções respiratórias altas Infecções respiratórias baixas Infecções gastro-intestinais Hemoculturas Cateteres vasculares Liquido cefalo-raquidiano.

Urina Considerações Gerais Nunca colher urina de arrastadeira, urinol ou saco de algália. Não enviar pontas de algália. Não colocar os dedos no interior do recipiente Enviar a urina o mais rapidamente possível para o laboratório. Semear até uma hora após a colheita ou refrigerar até 24 horas.  Métodos de colheita Jacto médio Punção de catéter urinário Punção supra-púbica Saco colector em crianças

Colheita do jacto médio – Mulher   1) Antes de iniciar a colheita efectuar a lavagem higiénica das mãos; 2) Com uma das mãos, afastar os grandes lábios e manter essa posição durante toda a colheita; 3) Com compressas embebidas em água e sabão (não utilizar anti-sépticos, pois podem inibir o crescimento dos microrganismos), proceder à lavagem da vulva da frente para trás, com uma compressa de cada vez, repetir a operação três vezes; 4) Usando o mesmo processo, lavar só com água esterilizada e secar; 5) Iniciar a micção, desprezando o primeiro jacto e colher 10-20cm3 para recipiente esterilizado de boca larga.

Colheita do jacto médio – Homem 1) Antes de iniciar a colheita efectuar a lavagem higiénica das mãos; 2) Afastar o prepúcio e manter essa posição durante toda a colheita; 3) Limpar a glande com compressas embebidas em água e sabão 4) Usando o mesmo processo, lavar agora só com água esterilizada e secar; 5)Iniciar a micção, desprezando o primeiro jacto e colher 10-20 cm3 para recipiente esterilizado de boca larga.  

Punção de catéter urinário - Doente algaliado Clampar a algália durante 10-15 minutos; Desinfectar com álcool a 70º a porção distal da algália; Com agulha e seringa estéreis aspirar a urina; Transferir a urina para recipiente esterilizado.

Punção supra-púbica Doente com bexiga cheia; Desinfectar a pele da região supra-púbica com a solução anti-séptica segundo a política de anti-sépticos do hospital; Com agulha e seringa estéreis, puncionar a pele e bexiga ao nível do 1/3 inferior da linha que une o umbigo à sínfise púbica; Aspirar a urina e colocá-la em recipiente esterililizado.

Na criança sem controlo dos esfíncteres Lavar muito bem com água e sabão toda a área genital; Limpar com água esterilizada;Secar com compressa esterilizada; Aplicar um saco autocolante estéril; Se, ao fim de 30 minutos não tiver urinado, retirar o saco e repetir todo o procedimento anterior; Transferir a urina para recipiente esterilizado.

Microrganismos mais frequentemente isolados na urina: E.coli, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae Enterococcus faecalis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococuus aureus Candida albicans Pseudomonas aeruginosa

Exsudado vaginal / uretral Exsudado vaginal:Colheita efectuada para pesquisa de Gardnerella vaginalis, Neisseria gonorrhoeae, Candidas e Trichomonas vaginalis. Exsudado uretral: Neisseria gonorrhoeae Raspado células epiteliais: Chlamydia trachomatis e Mycoplasmas genitais

Exsudado vaginal Colher com espéculo sem lubrificante ou humedecido com soro fisiológico estéril; Com uma zaragatoa de alginato de cálcio ou dacron colher a amostra da zona de maior exsudado ou do fundo de saco vaginal posterior. Repetir a operação com uma 2ª zaragatoa. - Uma das zaragatoas destina-se à execução do esfregaço a realizar no acto da colheita. A outra zaragatoa deve colocar-se em meio de transporte com carvão, que se deve manter à temperatura ambiente.

Exsudado uretral A amostra deve colher-se antes da 1ª micção da manhã. Se não fôr possível, esperar pelo menos uma hora após a última micção; Limpar cuidadosamente a mucosa circundante com gaze esterilizada; Introduzir uma zaragatoa fina e flexível até 2 cm dentro da uretra. Recolher o exsudado com um movimento de rotação para o exame directo a realizar no acto da colheita. Repetir a operação com uma 2ª zaragatoa para o exame cultural, que se deve introduzir em meio de transporte com carvão e manter à temperatura ambiente.  

Exsudado vaginal Pesquisa de Chlamydia Os métodos culturais são mais sensíveis e específicos, mas devido à sua complexidade e custo não são efectuados na rotina da maior parte dos laboratórios. Os métodos não culturais incluem a pesquisa de corpos elementares, antigénios, ác. nucleicos, por técnicas de imunofluorescência directa, EIA ou sondas de ác. nucleicos. As amostras adequadas não são as secreções, mas sim os raspados, já que a Chlamydia trachomatis se encontra nas células do epitélio cilíndrico. Não são adequadas amostras vaginais.

Exsudado vaginal Pesquisa de Chlamydia Esfregaço endocervical Remover o excesso de muco com zaragatoa de alginato de cálcio ou dacron; Inserir uma nova zaragatoa no canal endocervical e rodar; Evitar contacto com a mucosa vaginal; Transportar e conservar a amostra de acordo com a informação comercial utilizada

Exsudado uretral Pesquisa de Chlamydia Esfregaço uretral: Limpar qualquer exsudado; Inserir uma zaragatoa fina 2 a 4 cm na uretra e rodar; Restantes procedimentos iguais ao exsudado endocervical. O doente não deve urinar pelo menos 1 hora antes da colheita

Exsudado vaginal /uretral Pesquisa de Mycoplasma /Ureoplasma Remover o excesso de muco Inserir a zaragatoa e colher a amostra por raspagem vaginal ou uretral Colocar a zaragatoa no frasco com meio de transporte Enviar de imediato para o laboratório.

Pesquisa de Streptococcus  - hemolitico do grupo B Na gravida entre a 35ª - 37ª semana de gestação. É uma pesquisa de colonização para prevenção da sépsis neonatal precoce e importante para instituição pa profilaxia antibiótica na altura do parto.

Pesquisa de Streptococcus  - hemolitico do grupo B Colheita: Com zaragatoa colher uma amostra no terço inferior da vagina, com outra zaragatoa colher amostra no recto. Colocar as zaragatoas em meio de transporte sem carvão que se deve manter à temperatura ambiente. Enviar de imediato para o laboratório.

Infecções respiratórias altas Exsudado faringeo: Streptococcus - hemoliticos dos grupos A, C e G. Se solicitado pode ser efectuada a pesquisa de Arcanobacterium hemolyticum, Angina de Vincent, Corynebacterium diphteriae, Bordetella pertussis e N. gonorrhoea e N. meningitidis para despiste de portadores. Exsudado nasal: portadores de S. aureus meticilina resistente.

Infecções respiratórias altas Exsudado faringeo Não obter amostra se existir inflamação da epiglote, pois pode causar espasmos com consequente obstrução respiratória; Baixar a língua com espátula; Colher com zaragatoa apropriada ao microrganismo a pesquisar, entre os pilares e por detrás da úvula – faringe posterior, amígdalas e qualquer área inflamada ou ulcerada. (Evitar tocar nas bochechas, língua, úvula ou lábios); Enviar no meio de transporte apropriado ao microrganismo a pesquisar.

Infecções respiratórias altas Exsudado nasal Inserir uma zaragatoa estéril em cada narina até encontrar resistência (mais ou menos a nível dos cornetos); Rodar a zaragatoa contra a mucosa nasal; Colocar no meio de transporte.

Infecções respiratórias baixas Expectoração Pesquisa de: Streptococcus pneumoniae, H. influenzae, Moraxella catarrhalis, S. aureus. Pesquisa de Legionella pneumophila, Chlamydophila pneumoniae e Mycoplasna pneumoniae por detecção do antigénio ou de anticorpos.

Infecções respiratórias baixas Expectoração Preferir a 1ª amostra da manhã em jejum. Lavar a boca e gargarejar só com água antes de iniciar a colheita; Instruir o doente para colher expectoração por tosse profunda e não saliva ou secreções nasais; Colher o produto em recipiente esterilizado, de boca larga e que feche herméticamente.  

Infecções respiratórias baixas Expectoração Se o doente não conseguir expectorar esta pode ser induzida por: Cinesioterapia respiratória. Nebulização efectuada apenas com NaCl 0,85% (inalar 20 a 30 ml de uma solução de 3- 10% de NaCl 0,85% em H2O.

Aparelho gastro-intestinal Fezes – Exame Bacteriológico: Despiste por rotina de Salmonella spp, Shigella spp, Campylobacter jejunii/coli. Em certos casos e após contacto com o Laboratório: Yersinia enterocolítica,Vibrio, E.coli enterotoxigénica e Aeromonas hidrophyla.   O despiste de C. difficile é efectuado sempre que solicitado sendo as fezes colhidas sem meio de transporte.

Fezes Colheita: colher para um recipiente limpo e seco e transferir uma porção do tamanho de uma noz com muco, pús ou sangue para um recipiente com meio de transporte apropriado (meio de Cary-Blair ou meio com glicerol) Não são válidas amostras contaminadas com urina.

Fezes Exame parasitológico:    Despiste, por rotina, dos parasitas mais habituais entre nós. Para pesquisa de parasitas mais raros consultar o laboratório de microbiologia. A pesquisa de Cryptosporidium spp só se justifica em doentes imunocomprometidos e crianças em casos de diarreia comprovada.

Fezes Exame parasitológico É aconselhada a colheita de 3 amostras com 1 ou 2 dias de intervalo. Colheita para recipiente limpo e seco. No caso de fezes muito líquidas, colocar cerca de 5-10 ml de fezes em recipiente limpo e seco. No caso de fezes semi-moldadas, colocar uma porção do tamanho de uma noz em recipiente limpo e seco.

Hemoculturas Número e “timing” das colheitas: Habitualmente são suficientes 3 hemoculturas em 24 horas, colhidas separadamente, sendo o intervalo entre as colheitas variável conforme a situação do doente ou a urgência do início de administração de antibióticos. Um só frasco pode levar a que uma bacteriémia intermitente não seja diagnosticada assim como pode dificultar a interpretação do significado clínico de certos microrganismos isolados. Sépsis aguda: Três frascos de hemocultura colhidos separadamente e em locais diferentes antes de iniciar a terapêutica antibiótica

Hemoculturas Endocardite aguda - Obter três frascos de hemocultura por 3 punções venosas com 1-2 horas de intervalo e iniciar a terapêutica. Endocardite subaguda - Três frascos de hemocultura no 1º dia (intervalos de mais ou menos 15 minutos). Se 24 horas depois forem negativas, obter mais três.. Febre de etiologia desconhecida (SFI): Obter três frascos de hemocultura com, pelo menos, 1 hora de intervalo. Se estes são negativos 24-36 horas depois, colher mais duas hemoculturas com 1 hora de intervalo.(A informação obtida com mais de quatro hemoculturas é mínima.)

Hemoculturas O volume de sangue é crítico, porque a concentração de microrganismos na maioria das bacteriémias é baixa, especialmente se o doente já está com antibioterapia. Nas crianças a concentração de microrganismos durante as bacteriémias é maior que nos adultos pelo que é necessário menos sangue.  O volume de sangue a colher e recomendado é:   Crianças 1 - 5 ml por punção venosa Adultos 10 – 30ml por punção venosa

Hemoculturas Seleccionar a veia periférica a puncionar. Desinfectar o local da punção com álcool a 70% de modo concêntrico e do interior para a periferia. Repetir a operação com tintura de iodo a 2%, ou seguir a política de anti-sépticos do hospital; Deixar o desinfectante secar;  Nota: Não palpar a veia após a desinfecção da pele e antes de inserir a agulha, se isto acontecer repita todo o processo de desinfecção.  Desinfectar a rolha de borracha do frasco com álcool. Aspirar o sangue e inocular os frascos (sem mudar de agulha); Após a colheita, limpar a pele dos restos de iodo com álcool, para prevenir reacções adversas ao iodo; Arrumar o material de colheita de acordo com as Recomendações Básicas .Se pretender pesquisa de Brucella spp indique-o claramente na requisição pois este exame exige um tempo de incubação superior ao habitual.  Nunca refrigerar as hemoculturas.

Hemoculturas O volume de sangue a introduzir em cada frasco depende do volume de meio existente no frasco. A diluição final deve ser de 1: 5 a l:10. Habitualmente os frascos comercializados mencionam a quantidade de sangue a introduzir ou, então, a quantidade de meio existente no frasco.

Cateteres intravasculares O envio de catéter para exame bacteriológico só é aconselhado se existirem sinais de infecção relacionadas com o catéter.  A técnica utilizada é a de Maki, assim: Antes de retirar o catéter colher sangue para hemocultura de uma veia periférica, pois só assim será possível valorizar o exame cultural do catéter; Desinfectar a pele em redor do catéter, utilizando um anti-séptico de acordo com a política de anti-sépticos do hospital; Retirar o catéter; Cortar assepticamente cerca de 3-5 cm da porção terminal do catéter e colocá-lo em recipiente esterilizado.

Liquido céfalo-raquidiano Punção Lombar:  Desinfectar o local de colheita com uma solução anti-séptica e álcool, de acordo com a política de anti-sépticos do hospital; Inserir a agulha com o mandril. Quando o espaço subaracnoideu fôr atingido remover o mandril, o fluido espinal aparecerá na agulha; Recolher o líquor para tubo esterilizado de centrífuga com encerramento hermético. Habitualmente são necessários três tubos, que devem ser numerados; De imediato enviar o líquor ao laboratório. Nunca refrigirar o LCR. Nota: Devem realizar-se simultâneamente hemoculturas.