Expressão gênica diferencial entre os micélios monocariótico e dicariótico de Moniliophthora perniciosa Manuscrito submetido a MPMI e aceito com revisão Johana Rincones, Leandra M. Scarpari, Marcelo F. Carazzolle, Jorge M. C. Mondego, Eduardo F. Formighieri, Joan G. Barau, Gustavo G.L. Costa, Dirce M. Carraro, Laurival A. Vilas-Boas, Bruno V. de Oliveira, Maricene Sabha, Robson Dias, Júlio M. Cascardo, Ricardo A. Azevedo, Lyndel W. Meinhardt, and Gonçalo A.G. Pereira

Produção de basidiomas na estação das chuvas 4 a 8 semanas Micélio saprotrófico, dicariótico, intracelular e com grampos de conexão. Produção de basidiomas na estação das chuvas Mudança de forma entre 2 a 9 semanas 3 a 6 semanas Basidiósporos causam infecção em 4–6 h Micélio biotrófico formado por hifas primárias, monocarióticas, intercelulares e sem grampos de conexão.

Alterações bioquímicas

Micélio biotrophic-like in vitro

Materiais e Métodos RNA total (RNeasy Plant minikit - Qiagen) A-Sap-CM Saprotrófico induzido (CP02 em Fruto ou BP10 em glicerol + meristema) Saprotrófico controle (CP02 em 1% glicose ou BP10 em 2% glicerol) Biotrófico induzido (BP10 em glicerol + meristema) RNA total (RNeasy Plant minikit - Qiagen) A-Sap-CM E-Sap-CP A-Sap-Gly E-Sap-Glu Bio-CM

Microarrays Confeção dos microarranjos: 2304 clones do genoma em triplicatas (Flexys® Robot Arrayer - Perkin Elmer Life Biosciences) Marcação e Hibridização: 1. Bio-CM(Cy3) vs. A-Sap-Gly(Cy5) 2. Bio-CM(Cy5) vs. A-Sap-Gly(Cy3) 3. A-Sap-CM(Cy3) vs. A-Sap-Gly(Cy5) 4. A-Sap-CM(Cy5) vs. A-Sap-Glyl(Cy3) Normalização e análises: Nonlinear intensity-dependent dye bias (Lowess) Normalização entre réplicas técnicas (Bayesian) Seleção de genes (p-value < 0.05, fold change ≥ 2.0) Clusterização hierárquica (Green-Black-Red)

Bibliotecas de cDNA E-Sap-CP E-Sap-Glu Bio-CM Biblioteca Subtrativa: E-Sap-CP – E-Sap-Glu PCR Select® (Clontech) Bibliotecas de cDNA: Creator SMART® Library construction kit (Clontech) Seqüenciamento: MegaBACE 1000 Data mining: Filtros e clusterização (CAP3) Trimming Buscas NCBI NR (BLASTx) Buscas M. perniciosa genome (BLASTn) Anotação manual (FunCat)

Normalizadores: GPDH, ACT, 60S Real-time RT-PCR Microarrays (19): RICIN: Ricin_B_lectin CHISV: Chitin synthase class V LIP: Lipase class 3 LACC: Laccase 6 ALOX: Alcohol Oxidase DPP: Dipeptidyl-Peptidase MFS: Sugar transporter MFS PR-1: Pathogenesis Related 1 AROM: Arom polypeptide RAS: H_N_K_Ras_like HMPP: HMPP-kinase SP-1: Mediator complex subunit CYTCP: Ascorbate peroxidases MONO: Monooxygenase UEGP: UDP-glucose 4-epimerase TYR: Tyrosinase SRDK: Signal receiver domain INT: Integrase PMEVK: Phosphomevalonate kinase ESTs (16): GABAT: GABA Transporter GOX: Glyoxal Oxidase PP: Pathogenicity Protein CUT: Copper Transporter TRNAL: ASP tRNA Ligase PROH: Prohibitin STOM: Stomatin THAU: Thaumatin KP4: KP4 Toxin FDH: Formate Dehydrogenase MnSOD: Mn Superoxide Dismutase COX: Cytochrome Oxidase CERAT: Ceratoplatanin GLYP: Glycerol Permease NHBIO: No Hits Biotrophic NHSAP: No Hits Saprotrophic Normalizadores: GPDH, ACT, 60S

Microarrays: 1131 clones com sinais de hibridização consistentes para as triplicatas. 189 clones diferencialmente expressos entre os dois tipos de micélio

X

Discussão 1131 clones analisados por microarray 1534 ESTs analisados ~20% dos 12.000 genes de M. perniciosa Real-time RT-PCR validou o uso de estratégias complementares, e confirmou dois genes novos Biotrófico mostra alto metabolismo, mas pouco crescimento: Cross-talk molecular? Apoplasto é pobre em nutrientes solúveis. Nutrição efetiva do patógeno é pré-requisito para infecção bem sucedida (Ferreira et al. 2007).

Metabolismo de fontes de carbono Micélio saprotrófico: transporte de hexoses, ciclo de Krebs, ciclo das pentoses-fosfato e ciclo do malato Micélio biotrófico: degradação de lipídios, proteínas, celulose, pectina e alcóols. Uso de fontes de carbono alternativas e a baixa taxa de crescimento do biotrófico caracterizam uma possível CCR no biotrófico (Divon e Fluhr, 2007) CCR: Similar ao “diauxic shift”. Reprogramação metabólica que pode levar à mudança de fase (biotrófico muda para saprotrófico quando crescido em açucar).

Metabolismo de fontes de nitrogênio Micélio biotrófico crescido em 0,5% extrato de levedura: Amino ácido permeases GABA shunt tRNA ligases AROM: síntese de amino ácido aromáticos NCR: reprogramação metabólica (via AREA). Expressão de fatores de patogenicidade e a mudança de fase no hemibiotrófico Colletotrichum lindemuthianum (Dufresne et al. 2000)

Fatores de patogenicidade Glucuronyl hydrolase; degradação da parede celular Glyoxal oxidase 1: oxidação de aldeídos de cadeia curta (Ustilago maydis) Chitin synthase, classe V: proteção (Ustilago maydis) RICIN aglutinina: colonização do apoplasto Ceratoplatanina: toxina de Ceratocystis sp., causa necrose do cacau.

Metabolismo mitocondrial Biotrófico mostra menor taxa de crescimento: ngr1: regulação do crescimento de levedura mediante aceleração da degradação mitocondrial Saprotrófico em cacau mostra maior taxa de crescimento do que em glicose: Indução de citocromos, genes envolvidos em regeneração de NADH, ribosomos mitocondriais e proteção a estresse oxidativo

Elementos transponíveis Regulação diferencial destes elementos dependendo do tipo de micélio Possível relação com a geração de variabilidade genética neste fungo homotálico.

Proteínas antifúngicas Thaumatina-like: proteína de sabor doce, quando produzida por plantas tem efeito antifúngico KP4: killer protein produzida micoviruses. Linhagens de fungos que possuem o virus são resistentes. Possívelemente envolvidas em impedir a colonização do cacaueiro por fungos competidores Caso a KP4 possa inibir o crescimento de outras linhagens de M. perniciosa, ajudaria a manter homozigose

Modelo A fase biotrófica mostra pouco crescimento devido a baixa disponibilidade de nutrientes no apoplasto e ao controle do metabolismo mitocondrial Os sintomas da doença são causados mediante a ativação de genes de patogenicidade controlados por condições de CCR e NCR Estes fatores eventualmente causam a morte do tecido e a liberação de nutrientes solúveis no apoplasto A disponibilidade de nutrientes induz a mudança de fase Poderiamos induzir uma mudança de fase pela disponibilidade de nutrientes? Edvaldo!