Characterizing the physical genome Pollack, JR & Iyer, VR. Nature Genetics Supplement. Vol 32. Dec 2002.

Estrutura da cromatina O genoma é uma estrutura EXTREMAMENTE dinâmica. Genoma in silico = DNA Genoma in vivo = DNA + proteínas! Estrutura da cromatina

histona acetiltransferases (HATs) e histona desacetilases (HDACs) A expressão do genoma pode ser modificada por processos regulatórios, p.ex. (1) metilação do DNA (2) acetilação/desacetilação das histonas. histona acetiltransferases (HATs) e histona desacetilases (HDACs) DNA metiltransferases (DNMT)

OS FATORES DE TRANSCRIÇÃO SÃO RECRUTADOS: INÍCIO DA TRANSCRIÇÃO.

ELEMENTOS REGULATÓRIOS Um mesmo fator pode regular diversos genes!

Como as os fatores de transcrição, as modificações do DNA e a estrutura da cromatina atuam para especificar a expressão da informação genômica?

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) DNA-binding proteins are crosslinked to DNA with formaldehyde in vivo. Isolate the chromatin. Shear DNA along with bound proteins into small fragments. Bind antibodies specific to the DNA-binding protein to isolate the complex by precipitation. Reverse the cross-linking to release the DNA and digest the proteins.

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) abordagem direcionada: como um determinado fator de expressão regula a expressão de um determinado gene X? ChIP output = RT-PCR usando oligos gene X-específicos, primer walking no promotor. (2) abordagem ampla: quais genes um determinado fator de expressão Y regula? - ChIP output = clonagem e PCR usando oligos universais para sequenciamento, microarrays intergênicos.

INPUT Curva padrão Crosslink (formaldeído) Sonicação MBT A Anti-A Anti-A INPUT Curva padrão Imunoprecipitação DetecçãoPCR RT Reverse crosslink Purificação do DNA

ChIP-on-chip Crosslink protein to DNA in vivo with formaldehyde   Break open cells and shear DNA Immunoprecipitate (retira do pool aquelas sequencias não-ligadas ao Ab) Reverse-crosslinks, blunt DNA and ligate to unidirectional linkers Amplify and label (na amplificação há mais molde das sequências IP, e portanto Cy5 maior) Hybridize to array   

Novas abordagens utilizando os microarrays: alta resolução do genoma físico! (1) Distribuição dos sítios de ligação de proteínas ao longo de todo o genoma. (2) Mapeamento de modificações da cromatina e do DNA (3) Estudo da replicação/recombinação do DNA (4) Determinação de diferenças de cópias do DNA genômico (comparative genomic hybridization - CGH arrays)

Distribuição dos sítios de ligação de proteínas ao longo do genoma Epitope tag: digoxigenin, biotin, cyanin, GFP Cy5 = Tagged x Cy3 = noTag Alternativas: Cy5 = Ab contra ptn nativa x Cy3 = noIP Cy5 = Ab contra ptn nativa x Cy3 = IPgene Cy5 = IP glicose x Cy3 = IP metanol Desvios da razão Cy5/Cy3 indicam alteração na ligação da ptn alvo naquele sítio do DNA genômico.

Mapeamento de modificações da cromatina Yeast: IP com anticorpo que reconhece residuos de lisina acetiladas. Cy5 = IP wild x Cy3 = IPHDAs ALTERNATIVA: E.coli Dam metilase: fusão de ptn de interesse com Dam cria padrão de metilação atípico no DNA-alvo da ptn. Ao invés de imunoprecipitar, digerir com enzima de restrição sensível à metilação  cria fragmentos que são isolados por fracionamento de tamanho e hibridados em microarrays: Cy5 = ptn nativa x Cy3 = ptn-Dam Sítio de restrição Dam

Mapeamento de modificações do DNA Em mamíferos, o DNA genômico é metilado na maioria dos dinucleotídeos CpG, exceto nas chamadas (G+C)-rich-CpG islands – normalmente associadas a promotores funcionais. REPRESSÃO DA TRANSCRIÇÃO: ocorre recrutamento de ptns que se ligam a metil-CpGs e histonas deacetilases (HDACs)  silenciamento da expressão gênica pela cromatina. Este padrão de metilação é mantido inclusive durante a replicação do DNA (a fita molde guia a metilação da fita nascente). CÂNCER: padrão aberrante de metilação  hipermetilação das ilhas de CpG silencia os tumoral supressor genes.

Mapeamento de modificações do DNA Ilhas CpGs com padrão aberrantes de metilação NÃO SÃO reconhecidas pela enzima de restrição sensível a metilação. Cy5 = tumor x Cy3 = normal ALTERNATIVA: arrays de oligonucleotídeos permitem discriminar diretamente os dinucleotídeos CpG metilados e não metilados. COMO? C[un]  U C[met]  U X

Determinação de diferenças de cópias do DNA genômico (CGH arrays) DNA sonicado proveniente de amostras distintas é marcado e hibridizado contra fragmentos de DNA CONHECIDOS (cobertura total de cromossomos). Fornece maior resolução (~1 OG) que metodologias convencionais. Verde, deleções. Vermelho, amplificações.

Voltando ao ChIP FAK migra para núcleo quando cardiomiócito é estirado. O que ela vai fazer lá? Ratos sham x CoAo extração coração crosslinking DNA - ptn extrato nuclear sonicação  Input imunoprecipitação  anticorpo anti-FAK (2x) reversão do crosslinking isolar e purificar DNA clonagem sequenciamento

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ~2000 bp ~200 bp Southern blotting of sonicated genomic DNA. Lanes (each pulse refers to 10 seconds periods): 1 – non sonicated; 2 – 4 pulses, 50% potency; 3 – 6 pulses, 50% potency; 4 – 8 pulses, 50% potency; 5 – 4 pulses, , 100 % potency; 6 – 6 pulses, 100% potency; 7 - 8 pulses, 100 % potency; 8 – 2 pulses, 50% potency; 9 – 2 pulses, 50% potency; 10 – 10 pulses, 50% potency.

1 2 MW Bp Lane 1: amplification product from an empty plasmid. 23.130 9416 6557 4361 2322 2027 ~800 564 Lane 1: amplification product from an empty plasmid. Lane 2: amplification product from an plasmid containing the FAK immunoprecipitaded Phospholamban gene fragment. MW: molecular weight marker Lambda/HindIII.

Sequenciamento do fragmento imunoprecipitado por FAK (clonado e identificado por RNWS-LD-COR-040-F06-UC.F) e busca por similaridade através de Blastn contra banco de dados do genoma de rato (Rattus norvegicus). Em verde, a região com similaridade com a sequencia depositada (ref|NW_047601.2|Rn20_WGA2123_3 Rattus norvegicus chromosome 20 genomic contig). E-value: e-110. Em negrito, a região codificante do gene (início da tradução no códon ATG destacado). >RNWS-LD-COR-040-F06-UC.F date:2005-08-23.101956 NCCAGGGGGGGTTTGTTTGTCCTGACAAGCACCGACGCTTTCTCAACCCAACGTTTTAGC CCGCCTTTTGACGAATACTTTTTCCA AGGNCGCCGAAAAGAGGGCAGCTTTCATTTGGCT GCCTGTTGCCAACTTTTTATCTATCACTTGACCACTTAGAAAAACTTGTCTCCCTACTTT TGCCTTCCTGGCATA ATG GAAAAAGTGCAATACCTCACTCGCTCGNCTATCAGGAGAGCC TCCACTATTGAAATGCCTCAGCAAGCACGTCAGAATCTCCAGAACCTATTTATCAATTTC TGCCTCATCTTGATATGTCTGCTGCTGATCTGCATCATTGTGATGCTTCTGTGA AGAGCT GCCGCCACTCCAGACCTGCAACATGCCAACTCAGCTTA AAGCCGAGCACTCCGTCATGGG GGGAAGCAACGCACCGCTGCCTTTTCGGCTGAGAACAAGCTTTGTGGAGAGGGCACCGAT TTAAGAGTGGAAACTAAAATTGTTTAGGCCAANGGGAATTCAATCTGGCTGGGAAACCTG GGAAAAACCAAAACTTTTACCAGNGGGCCTAAAATGGTGGCCATAAATGGGAGGCTGGCC AAAAATTTCCCTCCAACAAAGGGGCGCAAAAAAATTTGCTTTTTCCTAAAAATAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGGAATTTTTTGGGGGGCCGCAAGAGGTTTTATTCCTTT TAAGGGGGGGGGTGATATTGTAGTCTTGGCCCTCGGGCCCGGGGTTTCCACAAACCCGGG GCCTGGGGGGGAAAAACACCACCGGTGGNGTAAACCCTCTTTTTTTGNTTTTGTGGGGGG GGAGCTTAAAANNNGNGNGNGGTANNNNGNGGNNNTNNNNNNNNNNNNNNNNTNAGNNGN NGGGNNGNGNNGNGNNNANNTGGTAGTGGCGTCGTTGTTTGGTGTTGTTGNCTGTGTAAT TNCTCGTGTGGGTTTCTCTCTGTTGCTCNNCNGTCGCGTCGGTCGTGTTTGCGTTCTTCT CTCCCCTGTGGCTCGTCCTTGTTCCGTTTCCGTGTCNTTTGCTTTTCCTTCCTTTTGTCA CTCTCGTTGCATT

BLASTn - Phospholamban [Pln] (Rattus norvegicus) cromossomo 20 HIT FragmentoF06 HIT Proteína ATG