Orientador: Profo Dr Gonçalo Amarante Guimarães Pereira Modificação de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae para o aumento da produtividade de álcool e floculação condicional Silvia Kazue Missawa Orientador: Profo Dr Gonçalo Amarante Guimarães Pereira

Introdução Saccharomyces cerevisiae Utilizado processo fermentativo Etanol Cachaça Cerveja Vinho O que é fermentação??

GLICÓLISE Vias Metabólicas FERMENTAÇÃO RESPIRAÇÃO (Schüller, 2003)

Processo Fermentativo Industrial (Meleiro & Maciel-Filho, 2000)

Genes Floculação Proteína de membrana FLO1 e FLO5: agregados são reprimidos por manose FLO10: agregados são reprimidos na presença de açucares (maltose, sacarose e glicose)

Processo Floculação

Floculação [ ] cálcio [ ] etanol nutrientes temperatura pH atividade mitocondrial

Atividade Mitocondrial Deficiência genoma da mitocôndria Altera características da superfície da célula PET191 - gene nuclear (Hutter &Oliver, 1998) montagem subunidades citocromo C oxidase Rompimento PET191 – aumento na produção de etanol (43%)

CONTROL OF SACCHAROMYCES CEREVISIAE FLOCCULATION BY SUGAR FOR INDUSTRIAL ETHANOL PRODUCTION Cunha, A.F. 1 , Missawa, S.K.1 , Gomes, L.H.2, Reis, S. F.3 and Pereira, G.A.G. 1 (1) Laboratório de Genômica e Expressão - Departamento de Genética e Evolução Instituto de Biologia –Universidade Estadual de Campinas - Campinas – São Paulo – Brazil (2) Universidade de São Paulo – ESALQ – Laboratório de Genética de Leveduras –Piracicaba, SP (3) Departamento de Parasitologia - Instituto de Biologia - Universidade Estadual de Campinas – Campinas - São Paulo – Brazil Submitted to: FEMS YEAST RESEARCH

Objetivos Artigo Floculantes condicionais Processo pedido patente (INPI no 0001122) Transferir a tecnologia para indústria Engenharia genética Uso promotor forte e condicional

Construção com o promotor MoxBB

Northern blot

Construção com o promotor ADH2

Transformação de linhagem industrial

Problemas Desfloculação dos agregados do gene FLO5 Floculação antecipada na linhagem industrial

Objetivos Avaliar o gene FLO10 Analisar crescimento das células e produtividade de etanol em linhagens de laboratório e industriais Deletar o gene PET191 para aumentar a produtividade de etanol

Materiais e Métodos Linhagens S. cerevisiae: W303-1a, JD7-7C, HD9315b Pedra2, Fleishman, Uvarum Plasmídeos YEp352-FLO5, pYADE4, pYADE4-FLO5

Amplificação e Clonagem do gene FLO10 Amplificação por PCR Clonagem em P-gem (Promega) Digestão Clonagem no pYADE4

Extração de RNA e Northern Blot Testes Floculação: Tempo de sedimentação Isolamento e caracterização de linhagens selvagens: RAPD Teste produtividade: Cromatógrafo a gás, ou destilação e desimetria

Resultados Parciais Amplificação do gene Flo10 FLO10BamF 5´ CGCGGATCCATGCCTGTGGCTGCTCG 3´ FLO10SalR 5´ ACGCGTCGACCTATTAAACGATTG CCAG 3´. Clonagem do gene Flo10 em Pgem SalI (3 e 3,5Kb) BamHI/SalI (3 e 3,5Kb) ScaI/SalI (1,1; 1,5; 1,8; 2,0Kb)

Construção do pYADE4-FLO10

Extração RNA e Northern

Seleção por canavanina em linhagens industriais

Cassete integrativo

Próximas Etapas Clonar o gene FLO10 com seu próprio promotor Transformação de linhagens industriais com cassete integrativo Desenvolver estratégia de desfloculação (FLO10) Deleção de PET191 Testes de floculação e produtividade