Testes para obtenção do melhores constitutivos em Arabidopsis thaliana para LGMV em diferentes tecidos de plantas selvagens Oligos utilizados: PDF2 At4g34270 At1g58050 At5g12240 UBQ1 (Rogério) AtAFDH (Rogério) Agradecimento as pequenas reuniões (Adriana, Camila, Roberto, Sinara) para discutir qual a melhor estratégia a ser utilizada durante a semana e a Sinara pela apoio nos programas
Duração dos testes: 3 semanas Testes de extração de RNAm Invitek Qiagen + DNAse qiagen + clean up Trizol + DNAse qiagen + clean up Trizol + Clean up + DNAse Promega Trizol + DNAse Promega + Stop Ainda faltam alguns testes: Invitek + DNAse Promega Invitek + DNAse qiagen + clean up Após a extração, o material foi quantificado em nanodrop. Confirmação do aparecimento de DNA genômico em RNAm comprovado por PCR de RNA. Alguns desses testes passaram por RT-PCR para verificar se o uso de diferentes métodos pode atrapalhar a síntese de cDNA.
Melhor teste obtido, porém, não necessariamente o de melhor qualidade: Infelizmente, por falta de tempo, e apenas com o intuito de otimizar e obter um RNAm sem contaminação de DNA, evitando o gasto de kits foram: Invitek: Raiz Trizol + Promega + Stop: caule, folha, flor, plântula Esse material, junto com o RNAm de semente extraído pelo Roberto, com uma metodologia diferenciada, foram utilizados para produção de cDNA e RT-PCR. Essas amostras também foram testadas para qPCR e tiveram bons resultados. O teste com 6 diferentes oligos para testar o melhor constitutivo estão nos slides seguintes. OBS: ao testar o material com cDNA e DNA genômico (extração apenas com trizol para controle), o primer at3g17010 mostrou apenas um pico de cDNA no qPCR indicando que nesta condição, não houve amplificação de DNA. Por outro lado, a mesma amostra utilizada em RT-PCR mostrou amplificação.
Tecidos utilizados: raiz, caule, folha, flor, plântula, sementes
Tecidos utilizados: raiz, caule, folha, flor, plântula