Técnicas Moleculares para detecção de patógenos ambientais

Apresentação em tema: "Técnicas Moleculares para detecção de patógenos ambientais"— Transcrição da apresentação:

1 Técnicas Moleculares para detecção de patógenos ambientais
Ecologia Microbiana Dra. Ana Paula Ramos

2 Objetivos da Aula: Informação genética
Replicação do DNA e elementos envolvidos Técnicas moleculares mais usadas Isolamento de material genético Técnicas de amplificação de ácidos nucléicos PCR e variações, PCR em tempo real Técnicas de amplificação do sinal -Hibridizações Fase sólida Blothings (Southern, Northern, Dot Blot) Fase líquida Técnicas para análise de seqüências -RFLP -RAPD Aplicações das técnicas

3 Composição do DNA e do RNA
DNA e RNA: estrutura, replicação e transcrição Ácidos Nucleicos são formados por “blocos de construção pareados”: purinas e pirimidinas (bases nitrogenadas) fosfato e açúcar Ligações químicas Composição do DNA e do RNA - DNA: carrega a informação genética - RNA: molécula intermediária entre a informação e a expressão gênica

4 DNA e RNA: estrutura, replicação e transcrição
Replicação do DNA: várias enzimas DNA Polimerase SSB (Single Strand Binding Protein) Primase Helicases DNA ligase

5 DNA RNA DNA e RNA: estrutura, replicação e transcrição Adenina Guanina
Citosina Timina Adenina Guanina Citosina Uracila Purinas Pirimidinas Açúcar Desoxirribose Ribose Fita dupla Fita simples

6 DNA e RNA: estrutura, replicação e transcrição
Transcrição e Tradução (expressão gênica): dogma central É o processo pelo qual uma molécula de RNA é sintetizada a partir da informação contida na sequência de nucleotídeos de uma molécula de DNA de fita dupla

7 Por que métodos moleculares??
Metodologia clássica x Métodos moleculares Dificuldade em recuperar as células de um sistema Microrganismos pouco concentrados em amostras ambientais (água...) Alto número de microrganismos viáveis, mas não cultiváveis (91 a 99%)

8 Estratégias gerais para estudar seqüências específicas de DNA
Amplificação específica Amplificação in vitro Detecção específica Hibridizações População a ser estudada Análise de seqüências RFLP, RAPD e sequenciamento

9 Isolamento e purificação do material genético
Remover qualquer material ou componente celular que possa interferir nas técnicas moleculares Recuperação celular: por centrifugação Lise celular: detergentes Desproteinização: uso de enzimas Extração de ácidos nucléicos Purificação de ácidos nucléicos Métodos diferentes para amostras diferentes

10 PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)
Amplificação in vitro de ácidos nucléicos: aumento da possibilidade de visualizar estas moléculas DNA molde (alvo) Iniciadores Nucleotídeos (dNTP’s) Íons Magnésio (necessários para ativar a enzima) DNA polimerase Tampão (manutenção do pH ótimo) Desnaturação: 95°C Anelamento: 55°C Extensão: 72°C 25 a 40 ciclos

11 REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE -PCR
Seqüência alvo

12 Ciclo da PCR - etapa 1 DESNATURAÇÃO DO DNA Seqüência alvo

13 HIBRIDIZAÇÃO DOS INICIADORES NO DNA ALVO
Ciclo da PCR - etapa 2 HIBRIDIZAÇÃO DOS INICIADORES NO DNA ALVO Seqüência alvo 3’ 5’ 5’ 3’ Iniciador 1 Iniciador 2 3’ 5’ 5’ 3’ Seqüência alvo

14 SÍNTESE DA CADEIA COMPLEMENTAR PELA TAQ DNA POLIMERASE
Ciclo da PCR - etapa 3 SÍNTESE DA CADEIA COMPLEMENTAR PELA TAQ DNA POLIMERASE Seqüência alvo 3’ 5’ 5’ 3’ Iniciador 1 Taq DNA Polimerase Iniciador 2 3’ 5’ 5’ 3’ Seqüência alvo

15 Final do primeiro ciclo da PCR
DUAS CÓPIAS DA SEQÜÊNCIA ALVO Seqüência alvo Seqüência alvo

16 Ciclos da PCR Desnaturação Hibridação Final do ciclo Extensão

17 Produtos de PCR 7 ciclos = 128 Amplicons
1 ciclo = 2 Amplicons 2 ciclos = 4 Amplicons 3 ciclos = 8 Amplicons 4 ciclos = 16 Amplicons 5 ciclos = 32 Amplicons 6 ciclos = 64 Amplicons 7 ciclos = 128 Amplicons No. No. Amplicons Ciclos Copias do DNA alvo

18 Visualização dos produtos de PCR por Eletroforese
Separação de moléculas por peso molecular: ácidos nucléicos ou proteínas Diferença de potencial entre dois eletrodos (+ e -) Matriz polimerizada : agarose e poliacrilamida

19 Variações da PCR RT-PCR – Transcrição reversa
Nested-PCR – Iniciadores internos, dois “rounds” de amplificação PCR Multiplex – Vários iniciadores ICC/PCR – PCR associada à cultura celular

20 Não segue o dogma central da biologia molecular
RT- PCR Não segue o dogma central da biologia molecular cDNA Transcrição Reversa RNA Trabalhar com DNA é mais estável ! Utilizado em estudos de expressão gênica Utilizado para detecção viral (vírus de RNA)

21 Nested PCR

22 Multiplex PCR

23 ICC-PCR (Integrated Cell Culture - PCR)
Para os casos nos quais há necessidade de aumentar a concentração microbiana e há muitos inibidores: amostras ambientais Amostra processada  Cultura Crescimento / efeito citopático Lise celular e extração dos ác. nucléicos do lisado RT-PCR / PCR Eletroforese: produto específico Deixa-se um tempo padronizado onde não é necessário observar crescimento / ECP, mas já é possível a detecção por PCR Ajuda na remoção de inibidores o que aumenta a sensibilidade da PCR Volume de análise muito maior

24 PCR em tempo real - quantitativo

25 Diagrama de um “sinalizador” molecular
Diagrama de um “sinalizador” molecular. Este sinalizador tem 33 nucleotídeos com um corante fluorescente (R) ligado ao terminal 5´ e um bloqueador de sinais (Q) no terminal 3´. As 9 bases do terminal 5´pareiam com as 9 bases do terminal 3´ e faz com que o sinal fluorescente fique muito próximo ao bloqueador. Quando o fluorescente é excitado ele é bloqueado pelo bloqueador e nenhuma fluorescência é detectada. As bases em rosa representam sequências que pareiam especificamente com o produto de PCR.

26 Detecção do produto do PCR pelo “sinalizador molecular”
Detecção do produto do PCR pelo “sinalizador molecular”. Quando o sinalizador liga-se ao produto de PCR (T°C de 5 a 10°C mais elevada que a T°C de anelamento dos primers), ele vai fluorescer quando excitado no comprimento de onda adequado. A quantidade de fluorescência é diretamente proporcional à quantidade de produto de PCR amplificada.

27 MÉTODO TAQMAN Sonda TaqMan® complementar a uma região interna do produto de PCR e ligada a um composto fluorescente. Quando a amplificação começa, a DNA polimerase corta a sonda, e a fluorescência é liberada. A fluorescência é liberada a cada ciclo, gerando um sinal fluorescente específico da seqüência.

28 Hibridização Moléculas individuais de ácidos nucléicos (fita simples) apresentam a capacidade de formar moléculas de fita dupla (hibridização) necessidade de alta complementaridade entre as bases para que isso aconteça; Sensibilidade menor que os métodos de amplificação gênica Utilizada para confirmação

29 Hibridização

30 Hibridização Sondas são marcadas direta ou indiretamente com enzimas, radioisótopos ou substratos quimioluminescentes / antigênicos, possibilitando a hibridização e detecção Fase líquida: captura híbrida Fase sólida: Southern e Northern blot, Dot Blot e Colony Blot

31 Fase Líquida: captura híbrida

32 Fase sólida: Ácidos nucléicos digeridos com enzimas de restrição e imobilizados em um suporte sólido
Enzimas de Restrição: enzimas isoladas de procariotos que reconhecem seqüências específicas no DNA dupla fita.

33 Fase sólida: Ácidos nucléicos imobilizados em um suporte sólido
Southern e Northern Blot

34 Dot Blot : ácido nucléico diretamente imobilizado em membranas, vácuo

35 Análise de seqüências RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism – Polimorfismo do tamanho dos fragmentos de restrição) – Tipagem exemplo: variações dentro do gene rRNA, que é conservado Comparação entre o número e o tamanho dos fragmentos; Variações no tamanho dos fragmentos gerados por distintas amostras de DNA após clivagem enzimas de restrição; Padrões de bandas diferenciados indicam organismos distintos geneticamente (mesma espécie ou não);

36 Análise de seqüências RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA – DNA polimórfico randomicamente amplificado)- DNA fingerprinting PCR utilizando-se iniciadores aleatórios em baixa estringência (especificidade no produto de DNA a ser amplificado) Não é necessário um conhecimento prévio do genoma Uniformidade no padrão de bandas para espécies relacionadas

37 DNA Desnaturação a 95oC DNA

38 Extensão a 72ºC

39 Fragmentos de RAPD 400bp 310bp 260bp 75bp

40 Visualização de Fragmentos de RAPD

41 Utilização de técnicas moleculares na avaliação e detecção da diversidade microbiana
Diferentes técnicas : quando se conhece ou não o genoma do organismo estudado Processamento das amostras é de extrema importância ácidos nucléicos de boa qualidade, pureza e, principalmente, com mínimo de inibidores

42 Análise de contaminação bacteriana e viral em moluscos

43 Análise de contaminação bacteriana e viral em moluscos:
O LVA vem trabalhando na avaliação da contaminação em moluscos desde aproximadamente 10 anos; Importância devido o grande destaque de Florianópolis e região na Maricultura Moluscos: animais filtradores concentram patógenos Salmonella spp. Vírus: RNA Hepatite A, Rotavírus, Norovírus, Poliovirus DNA Adenovírus, Poliomavírus,

44 Necessidade de diminuição de inibidores presentes na carne de ostras e enriquecimento da amostra em meio de cultivo (viabilidade e aumento do número de células)

45 Análise de contaminação viral em amostras de águas:

46 Método de filtração e concentração
(Katayama et al., 2002) Centriprep - Millipore

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48 Problemas... Alto custo da infra-estrutura do laboratório e reagentes;
Diferenciação entre células viáveis e não viáveis; depende da técnica e do organismo a ser estudado Dificuldade em pesquisar quando o genoma do microrganismo não é conhecido.

49 PROJETOS EM ANDAMENTO : MAPA L-2/CNPq: IMPLEMENTAÇÃO DE TÉCNICAS DE DEPURAÇÃO DE OSTRAS DE CULTIVO QUE VISEM GARANTIR A QUALIDADE E INOCUIDADE DO PRODUTO. : Ed. Universal/CNPq 2007 : VALIDAÇÃO E APLICAÇÃO DE MÉTODOS MOLECULARES PARA QUANTIFICAÇÃO DE VÍRUS HUMANOS DE INTERESSE EM SAÚDE PÚBLICA E MEIO AMBIENTE: Rotavírus, adenovírus e vírus da hepatite A como modelos de contaminação de águas ambientais : Ed. FINEP/SEBRAE: Produção de ostras triplóides da espécie Crassostrea gigas.. 30/11/2008 a 30/10/2009 FAPESC: Produção de sementes de ostras triplóides (3n) para a maricultura catarinense. : AECID: “Agencia Espanola de Cooperación Internacional para el Desarollo” (INTERNATIONAL COLABORATION BETWEEN UFSC AND BARCELONA UNIVERSITY FOR HUMAN EXCHANGE) : Desenvolvimento de métodos para a detecção e quantificação de vírus em moluscos. 49