Polymerase Chain Reaction (PCR)

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1 Polymerase Chain Reaction (PCR)
Polimerase Chain Reaction Polymerase Chain Reaction (PCR) Pedro Teiga Ricardo Ladeiras Sofia Marques 21 Abril 2005

2 Polimerase Chain Reaction
A invenção da PCR 1983 Kary Mullis 1985 1º paper 1993 Nobel da Química Inventado por Kary Mullis em 1983. Primeira publicação em 1985. A partir de 1988 há uma grande divulgação e utilização Recebeu Prémio Nobel da Química em 1993.

3 PCR, a ferramenta do futuro
Polimerase Chain Reaction PCR, a ferramenta do futuro Grande quantidade de DNA em pouco tempo. Baixo custo A amostra de DNA não necessita de estar altamente purificada. PCR pode amplificar uma única molécula de DNA / RNA. O produto do PCR pode ser digerido com enzimas de restrição, sequenciado ou clonado. Aumento exponencial PCR permite amplificar uma quantidade útil de DNA (visível em electroforese) em ~2 horas???. — uma colónia de bactérias fervida. ex: de um espermatozóide RNA – 1º trancriptase reversa

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A reacção Desnaturação at 95°C : A cadeia dupla abre, pelo rompimento das pontes de H, separando-se em cadeias simples Param todas as reacções (extensão que esteja a ocorrer de um ciclo anterior) Annealing at 55°C : Os primers ligam-se ao sítio certo? nem todos Os Primers estão constante/ em movimento, forças electroestáticas são constante/ formadas e rompidas entre o primer de cadeia simples e o template cadeia simples. Pq é que o primer n se liberta do template?? As ligs + estáveis (primers que encaixam exactamente) duram + tempo e: nessa pequena porção de DNA cadeia dupla (template e primer) a polimerase pode ligar e começar a copiar o template. Assim que temos algumas novas bases encorporadas na cadeia a lig iónica é tão forte entre o template e o primer quer não se volte a romper. Extensão at 72°C : Temperatura ideal p actuação da polimerase. Nos primers c algs bases incorporadas as forças iónicas superam as forças de ruptura Primers q n coincidem exactamente soltam-se outra vez e não ocorre polimerização (nesses locais) As bases são adicionadas na extremidade 3’ do primer (a polierase adiciona dNTP’s de 5’ p 3’), lendo o template de 3’ p 5’; as bases são adicionadas por complementaridade de bases

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O que envolve a reacção? DNA Template Tampão da reacção (Tris, iões amónio (e/ou iões de potássio), iões de magnésio soro de albumina de bovino) Nucleótidos (dNTPs) Primers DNA polymerase (pex: Taq, Pfu) 2 primers

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Quantos ciclos? Aumentar o número de ciclos acima de ~35 traz reduzidas vantagens. O valor máximo é atingido quando: Esgotam os reagentes Os produtos re-anneal A polymerase se degrada Acumulação de produtos indesejados. crescimento exponencial

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Termo-Cicladores PCR cyclers available from many suppliers. Many block formats and multi-block systems. Reactions in tubes or 96-well micro-titre plates. The PCR technique and the use of Taq DNA polymerase in PCR are both patented. Even academic and public organisations must pay license fees. Taq patent still being challenged (Promega).

8 Polimerase Chain Reaction
Funcionou? Se não…o que fazer? Check a sample by gel electrophoresis. Formou-se apenas uma banda? O produto tem o tamanho esperado (bandas no gel)? May need to optimize the reaction conditions.

9 Optimização da reacção de PCR
Polimerase Chain Reaction Optimização da reacção de PCR Temperatura Tempos Concentração de Mg2+ na reacção. Quantidade de template e de polymerase Temperatura de annealing dos primers e de extensão. The concentration of Mg2+ in the reaction. The extension time. The fidelity of the PCR depends on [Mg2+]. Vary [Mg2+] in steps of 0.5 mM.?? Sometimes a compromise between yield and specificity.

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DNA polimerases.. E. coli Taq Pfu – proofreading rTth DNA Polymerase 1985 – 1ª utlilização do PCR c uma enz termosensível da E coli Desvantagem - adições suplementares de enzima em cada ciclo A 37ºC ocorria um annealing ñ específico dos primers, logo, produtos n desejados Taq Thermus aquaticus - bactéria nativa de fontes quentes de Yellowstone Vantagem – suporta temperaturas até 95ºC sem desnaturar requer 75ºC permitindo um resultado final mais uniforme Pfu polymerase – deriva de Pyrococcus furiosus Vantagem – é mais eficaz a ~100ºC; tem um passo adicional proofreading – detecção, remoção e correcção de erros nas ligs por complementaridade de bases (A com G/C) elevada precisão rTth DNA Polymerase transcriptase reversa, uma das suas versões tem proof-reading

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Fidelidade da reacção A Taq comete ERROS Qual a importância dos erros? Como superá-los? A Taq comete ERROS Taq DNA polymerase lacks the 3´®5´ proof-reading activity commonly present in other polymerases. Taq mis-incorporates 1 base in 10^4. A 400 bp target will contain an error in 33% of molecules after 20 cycles. Error distribution will be random. Qual a importância dos erros? Yes, if you want to clone the amplified DNA — an individual molecule may harbour several mutations. No, if you want to sequence the amplified DNA or cut it with restriction enzymes. Como superá-los? Use a proof-reading thermo-stable enzyme rather than Taq. Ex: Pfu; rTth DNA Polymerase

12 Concepção dos PCR Primers
Polimerase Chain Reaction Concepção dos PCR Primers Comprimento: especificidade vs eficácia Temp de annealing Composição de bases Extremidade 3’ Regiões repetitivas do DNA Enzimas de restrição Estrutura secundária Homologias Intra e Inter-primer Primers should be ~20 bases long. Podem ser menores p DNA menos complexo Os 2 primers n devem ter uma diferença de temp de annealing (TA) superiores a 1ºC e ela deve ser 5º inferior à temp de melting (pelo menos de 50º) The primers must not base pair with each other or with themselves – dímeros de primers – or form hairpins. Redução da eficácia da amplificação The Composição de bases: G/C content should be 45–55% evitar Polipurinas e polipirimidinas The 3´-most base should be a G or C. P assegurar uma correcta ligação da ext 3’ do primer por ponte de hidrogénio + forte. Evitar a complementaridade de bases entre primers na extremidade 3’ Primers must avoid repetitive DNA regions (Tandem repeats) Addition of restriction enzyme sites to the 5' end of the primers serve as useful vehicles for subsequent subcloning. Primer3 program at the Whitehead Institute is the most reliable and versatile tool currently available. CODEHOP: COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primers

13 Primers a formar Hairpins e Dímeros
Polimerase Chain Reaction Primers a formar Hairpins e Dímeros Complementaridade intra-primer – dobra em hairpin: Dímero de primers (intra ou inter primer). A primer may be self-complementary and be able to fold into a hairpin: A primer may form a dimer with itself or with the other primer. The 3´ end of the primer is base-paired, preventing it annealing to the target DNA.

14 Polimerase Chain Reaction
Aplicações do PCR Multiplex PCR Real Time PCR PCR na detecção de polimorfismos e mutações patológicas PCR e a amplificação indiscriminada de sequências de DNA PCR na amplificação de sequências de DNA desconhecidas PCR assimétrico PCR e clonagem de DNA genómico PCR e clonagem de cDNA PCR e DNA Fingerprinting: casos da Biologia Forense e da Filiação genética What is PCR used for? Once amplified, the DNA produced by PCR can be used in many different laboratory procedures. For example, most mapping techniques in the Human Genome Project (HGP) rely on PCR. PCR is also valuable in a number of newly emerging laboratory and clinical techniques, including DNA fingerprinting, detection of bacteria or viruses (particularly AIDS), and diagnosis of genetic disorders.

15 Polimerase Chain Reaction
Multiplex PCR Reacções PCR em que várias sequências alvo são amplificadas simultâneamente — comum nas aplicações de diagnóstico.

16 Polimerase Chain Reaction
Real time PCR Fairly recently, a new method of PCR quantification has been invented. This is called “real-time PCR” because it allows the scientist to actually view the increase in the amount of DNA as it is amplified. Several different types of real-time PCR are being marketed to the scientific community at this time, each with their advantages. This web site will explore one of these types, TaqMan® real-time PCR, as well as give an overview of the other two types of real-time PCR, molecular beacon and SYBR® Green. ( 2003)

17 PCR usado na detecção de polimorfismos e mutações patológicas

18 Para detectar polimorfismos de local de restrição
O que são polimorfismos? Porque existem os polimorfismos? Como se detectam esses polimorfismos?

19 PCR específico para um alelo e detecção de mutações
Como se consegue discriminar entre duas sequências alvo que difiram num único nucleotídeo? Um só nucleotídeo faz a diferença? Como se interpretam os resultados?

20 PCR permite amplificação indiscriminada de sequências de DNA
Qual a vantagem?

21 Linker-primed PCR Como decorre? O que é o linker?
Que primers são usados?

22 PCR usado para amplificar uma regiões desconhecidas que flanqueiam uma região previamente caracterizada Qual a vantagem?

23 PCR inverso Quando se utiliza? Como são os primers?
Como decorre o processo?

24 Os produtos amplificados do PCR são usados na sequenciação de DNA

25 PCR assimétrico Com que fim se utiliza? Porquê assimétrico?

26 Polimerase Chain Reaction
Clonagem de DNA genómico ↓ Clonagem de cDNA ↓ Clonagem de DNA genómico vs. Clonagem de cDNA Já ouvimos falar da técnica mas como a aplicar ao nosso dia-a-dia? Clonagem de DNA genómico Muito simples. Depois de fazermos uma extracção e purificação do DNA das células, Adicionamos “primers” que flanqueiam a região do genoma que pretendemos amplificar (pode ser um oncogene, uma região que codifica uma determinada enzima, etc).No fim, iremos obter uma quantidade enorme do segmento genético que queríamos amplificar para, por exemplo, o podermos analisar ou sequenciar. Clonagem de cDNA -O que é? Molécula de DNA complementar da molécula de mRNA que codifica uma determinada proteína -Como fazer? -Extracção e purificação do mRNA que nos interessa -adição de um primeiro “primer” e utilização da RT para sintetizar uma cadeia simples de DNA complementar à d mRNA -adição do 2º primer e a molécula de DNA de cadeia simples é amplificada através de vários ciclos de PCR Vantagens? Não necessitaríamos de “splicing” para conseguir sintetizar esta proteína pois a molécula de cDNA obtida e amplifica não possui intrões

27 PCR e DNA Fingerprinting
Polimerase Chain Reaction PCR e DNA Fingerprinting Existe alguma relação? - algumas sequências de DNA não codificante encontram-se repetidas em número variável e são encontradas em várias posições (“loci”) do genoma humano - o número de vezes que se repetem é altamente variável na população - uma série de nucleotídeos repetidos desta forma é chamada “hypervariable microssatelite sequence”, também conhecida como sequência VNTR (“variable number of tandem repeat”) - assim, um indivíduo herda normalmente uma variante diferente de cada um dos seus progenitores Exemplo: D1S80 -tem uma unidade de repetição de 16 pares de bases - encontra-se na região não codificante do cromossoma 1 - neste “locus”, a maioria dos indivíduos possui alelos que contêm entre 14 e 40 unidades de repetição Exemplo: “locus” D1S80

28 PCR e DNA Fingerprinting
Suas principais aplicações: Biologia forense (ex. confirmação do autor de um crime) Filiação genética (ex. testes de paternidade)

29 Polimerase Chain Reaction
Como fazer na biologia forense? -utilização de “primers” que flanqueiam os “loci” a analisar e fazemos correr o PCR, o que fará a amplificação exponencial dos “loci” k nos interessam. De seguida fazemos separação em gel de electroforese O que vamos obter? Quando interpretarmos o resultado da electroforese iremos ter duas bandas para cada indivíduo: uma delas representa a variante materna enquanto a outra representa a variante paterna Interesse? Quando estamos a examinar a variabilidade em 5 a 10 VNTR “loci” diferentes, a probabilidade de dois indivíduos aleatórios, ou seja, não geneticamente relacionados, partilhar o mesmo padrão genético em todos eles é d aproximadamente 1 em 10 biliões

30 PCR e Filiação genética
Polimerase Chain Reaction PCR e Filiação genética Pai Mãe Neste caso, a filiação genética. Podemos observar que os dois progenitores não partilham o mesmo padrão genético neste “locus” que estamos a analisar. Analisando a árvore genealógica: Concluímos que qualquer um dos descendentes possui um um alelo herdado do pai e outro da mãe o que nos permite estabelecer uma relação entre esses indivíduos Quando comparamos os diversos padrões genéticos desta família com o d um indivíduo aleatório, observamos o aparecimento imediato de um novo padrão genético

31 Polimerase Chain Reaction
O futuro da PCR PCR ↔ material genético Fotocopiadora ↔ material escrito tornando a cópia fácil, barata, acessível A evolução irá permitir: - redução dos custos - diminuição do tamanho dos aparelhos - generalização da técnica, podendo esta ser feita, por exemplo, no consultório médico

32 O futuro da PCR Com a técnica de PCR iremos desvendar o nosso passado genético, bem como abrir o caminho para um futuro geneticamente traçado.

33 Agradecimentos Drª. Clara Monteiro Drª. Susana Pereira, IBMC
Este trabalho foi possível com a ajuda de.. Drª. Clara Monteiro Drª. Susana Pereira, IBMC Drª. Marta Pinto

34 Referências Tom Strachan, Andrew P. Read Human: Molecular Genetics;BIOS Scientific Publishers Limited; 1996; USA James D. Watson, Michael Gilman, Jan Witkwoski, Mark Zoller: Recombinant DNA; second edition; 1992; New York,Scientific American Books Geoffrey M Cooper: The Cell, a molecular approach; second edition Alkami quick guide tm for PCR Rui Pereira; Biologia forense; Nov 2004 A. Silva, A. Fonseca, C. Teixeira, E. Sousa; FCUP; Testes de paternidade Raymond Dalgleish; Department of Genetics; The Polymerase Chain Reaction (PCR) Site: