Reprodução e crescimento microbiano

Apresentação em tema: "Reprodução e crescimento microbiano"— Transcrição da apresentação:

1 Reprodução e crescimento microbiano

2 Introdução ao crescimento microbiano
Crescimento: aumento ordenado de todos os componentes do sistema biológico → aumento da massa celular → multiplicação celular Em microrganismos que se dividem por fissão ou por gemulação → aumento do número de indivíduos

3 Pontos de vista de estudo:
Individual : ciclo celular Replicação e segregação de cromossomos Síntese de novos materiais dos envoltórios celulares Coordenação da replicação e divisão celular Ciclo celular Sequência de eventos identificáveis que ocorrem desde que surge uma nova célula até que esta se divida em duas filhas. Populacional Cinética de crescimento Fatores que afetam o tempo de geração Fatores ambientais que afetam o crescimento

4 MULTIPLICAÇÃO BACTERIANA PELA FISSÃO BINÁRIA

5 Ciclo celular eucariótico
Mitose Crescimento Células-filhas Crescimento inicial Síntese de DNA DNA polimerase e reparo de dano no DNA

6 Em microbiologia, o termo crescimento refere-se a um aumento do número de células e não ao aumento das dimensões celulares. Crescimento Populacional: é definido como o aumento do número, ou da massa microbiana. Taxa de crescimento: é a variação no número ou massa de microrganismos por unidade de tempo. Tempo de geração: é o intervalo de tempo necessário para que uma célula se duplique. O tempo de geração é variável para os diferentes organismos, podendo ser de 10 a 20 minutos até dias, sendo que em muitos dos organismos conhecidos, este varia de 1 a 3 horas. O tempo de geração não corresponde a um parâmetro absoluto, uma vez que é dependente de fatores genéticos e nutricionais, indicando o estado fisiológico da cultura.

7 O tempo de geração pode ser calculado quando uma cultura encontra-se em fase exponencial, pela fórmula abaixo: N=No.2n onde N= número final de células No= número inicial de células n= número de gerações n= log(N) - log(No)/0,301 g = t/n , onde g= tempo de geração t= tempo de crescimento n= determinado acima.

8 Curva de crescimento (cultura descontínua) Quando uma cultura microbiana desenvolve-se em um sistema fechado, pode-se confeccionar uma curva de crescimento. Esta pode ser dividida em diferentes etapas: lag, log, estacionária e de declínio.

9 Lag: período variável, onde ainda não há um aumento significativo da população. Ao contrário, é um período onde o número de organismos permanece praticamente inalterado. Esta fase é apenas observada quando o inóculo inicial é proveniente de culturas mais antigas. A fase lag ocorre porque as células de fase estacionária encontram-se depletadas de várias coenzimas essenciais e/ou outros constituintes celulares necessários à absorção dos nutrientes presentes no meio. A fase lag também é observada quando as células sofrem traumas físicos (choque térmico, radiações) ou químicos (produtos tóxicos), ou quando são transferidas de um meio rico para outro de composição mais pobre, devido a necessidade de síntese de várias enzimas. Assim, durante este período observa-se um aumento na quantidade de proteínas, no peso seco e no tamanho celular.

10 Log ou exponencial: nesta etapa, as células estão plenamente adaptadas, absorvendo os nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando. Deve ser levado em conta também que neste momento, a quantidade de produtos finais de metabolismo ainda é pequena. A taxa de crescimento exponencial é variável, de acordo com o tempo de geração do organismo em questão. Geralmente, procariotos crescem mais rapidamente que eucariotos. S. cerevisiae : g= 90 minutos E. coli : g= 20 minutos Nesta fase são realizadas as medidas de tempo de geração. Geralmente, ao final da fase log, as bactérias passam a apresentar fenótipos novos, decorrentes do processo de comunicação denominado "quorum sensing".

11 Estacionária: Nesta fase, os nutrientes estão escasseando e os produtos tóxicos estão tornando-se mais abundantes. Nesta etapa não há um crescimento líquido da população, ou seja, o número de células que se divide é equivalente ao número de células que morrem. É na fase estacionária que são sintetizados vários metabólitos secundários, que incluem antibióticos e algumas enzimas. Nesta etapa ocorre também a esporulação das bactérias. Foram detectados alguns genes (sur) que são necessários à sobrevivência das células na fase estacionária. Além destes, existem outros genes (fatores s alternativos da RNA polimerase, proteínas protetoras contra dano oxidativo).

12 Declínio: A maioria das células está em processo de morte, embora outras ainda estejam se dividindo. A contagem total permanece relativamente constante, enquanto a de viáveis cai lentamente. Em alguns casos há a lise celular. Culturas descontínuas tendem a sofrer mutações que podem repercutir na população como um todo. As próprias condições ambientais tendem a promover variações de caráter fenotípico (reversível) nas culturas.

13 Crescimento em culturas contínuas: técnica muito usada nos processos industriais de obtenção de produtos microbiológicos.Nestes casos, tem-se o interesse em manter as células em fase log ou estacionária. Utilizam-se fermentadores ou quimiostatos, que permitem um crescimento em equilíbrio dinâmico, havendo assim um controle da densidade populacional e da taxa de crescimento. Estes são respectivamente controlados pela concentração do nutriente limitante (fonte de C ou N) e pela taxa de fluxo (taxa de diluição). Em baixas concentrações do nutriente limitante, a taxa de crescimento é proporcional à concentração do nutriente (que é virtualmente zero).

14 ESQUEMA DE UM QUIMIOSTATO Entrada de Regulador de fluxo meio fresco
Espaço não preenchido Cuba ESQUEMA DE UM QUIMIOSTATO Cultura Saída Efluente

15 Crescimento sincronizado: inicialmente obtido por processos que retardavam a síntese de DNA. Atualmente, utiliza-se métodos de separação mecânica das células menores, recém-divididas. Pode ser feita pela filtração em vários papéis de filtro, que retém células maiores, em fase de divisão.

16 MÉTODOS PARA QUANTIFICAÇÃO DO CRESCIMENTO MICROBIANO

17 CONTAGEM DIRETA AO MICROSCÓPIO CÂMARA DE NEUBAUER Ao microscópio – aumento de 400X Ao microscópio – aumento de 100X

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19 Coloração com azul de metileno para evidenciar células viáveis de leveduras – células azuis estão mortas; células sem coloração são células vivas

20 CONTAGEM EM PLACA E DILUIÇÕES SERIADAS

21 METODOLOGIA UTILIZADA PARA A CONTAGEM DE COLÔNIAS EM PLACA POUR-PLATE ESPALHAMENTO EM PLACA

22 DETERMINAÇÃO DE CRESCIMENTO MICROBIANO POR
Fonte de luz Filtro Amostra contendo células microbianas Detector sensível á luz Leitura dos resultados em absorbância ou transmitância no espectrofotômetro DETERMINAÇÃO DE CRESCIMENTO MICROBIANO POR TURBIDIMETRIA

23 CURVA-PADRÃO PARA O CÁLCULO DE CRESCIMENTO MICROBIANO POR TURBIDIMETRIA

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25 ↓ A membrana filtrante foi colocada sobre o meio de cultura e a placa foi incubada. ↓ Células bacterianas na superfície da membrana (poros) CONTAGEM DE BACTÉRIAS PELO MÉTODO DE FILTRAÇÃO

26 MÉTODO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL PARA ESTIMATIVA DE CRESCIMENTO