Nanotecnologia Mestrandos: Amanda Lima Daniele Aimi Denise Baldissera Ricardo Lorenzoni Professoras: Dra. Marta Palma Alves Dra. Renata Raffin Dra. Solange.

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1 Nanotecnologia Mestrandos: Amanda Lima Daniele Aimi Denise Baldissera Ricardo Lorenzoni Professoras: Dra. Marta Palma Alves Dra. Renata Raffin Dra. Solange Fagan 1

2 Fator de Impacto: 5,42

3 3 3 Antígeno Prostático Específico (PSA): Glicoproteína – composta de 93% de peptídeo e 7 % de açúcar. Produzido exclusivamente pelo tecido prostático. Melhor marcador sérico que esta disponível para o diagnóstico e tratamento do câncer de próstata. Não existe tratamento curativo para o câncer de próstata, portanto, a melhor maneira de tentar diminuir as taxas de mortalidade desta doença é detectá-la o mais cedo possível - enquanto a patologia esta confinada a prostata. Introdução

4 4 4 PSA (no organismo) COMPLEXADO com inibidores da protease LIVRE α1- Antiquimiotripsina e α2-macroglobulina Forma complexa predominante e imunoreativo. Não é imunoreativo. Podem ser determinados para auxiliar no diagnóstico do câncer de próstata. Homens normais: < 4 ng/ml Câncer: > 20 ng/ml Quando os valores apresentam-se entre 4 e 20 ng/ml exames complementares devem ser realizados. Por isso, os ensaios de PSA são recomendados para auxiliar no diagnóstico ou monitorar o tratamendo do câncer de próstata. Introdução

5 5 5 Ensaios para detecção do PSA: Envolvem anticorpo de PSA monoclonal ou policlonal marcados com uma enzima, fluorocromo ou isótopo radioativo. Embora esses métodos sejam sensíveis e específicos, apresentam algumas desvantagens: Complexidade intrínseca; Necessidade de reagentes; Vários passos para execução; Amplificação do sinal; Tamanho de amostra relativamente grande; Análise de dados complexos e de alto custo; Portanto é altamente desejável que se desenvolva métodos de alta sensibilidade e especificidade, detecção em tempo real, rápido, flexível, portátil, descartável e de baixo custo. Introdução

6 6 6 Os Biosensores de NTC-FET podem satisfazer todos os quesitos referidos. A superfície dos NTC pode ser funcionalizada com moléculas de receptores específicos, que se ligam as biomoléculas desejadas. Quando as moléculas alvo se ligam as moléculas receptoras que estão em solução, as cargas das moléculas alvo alteram a condutância dos NTC-FET. Introdução

7 7 As biomoléculas alvo (PSA) devem estar dentro da faixa de comprimento de Debye em torno do NTC-FET. No entanto, a dimensão dos anticorpos utilizados como receptores, normalmente é muito maior que o comprimento de Debye, o que implica que as moléculas alvo não podem se aproximar do NTC-FET provocando alteração na condutância do biosensor. 7 Introdução A estratégia para superar esse problema é utilizar receptores pequenos, como aptâmeros, peptídeos e fragmentos de anticorpos de ligação, intercalados com espaçadores, melhorando a ligação e interação entre a molécula alvo e o biosensor.

8 8 8 Introdução No trabalho, os autores relataram a primeira demonstração bem sucedida de um um biosensor de NTC-FET usando o 1-pyrenebutanoic acid succinimidyl ester como ligador e o 1-pyrenbutanol como espaçador. Os NTC foram funcionalizados contendo diferentes relações ligador e espaçador. a)Ligador b)Ligador: espaçador 1:1 c)Ligador: espaçador 1:3 d)Ligador: espaçador 1:9 e)Somente espaçador A resposta foi monitorada em tempo real, apóos a introdução do complexo antígeno prostático específico conjugado com α1- Antiquimiotripsina, em diferentes concentrações (0,1 – 500ng/ml)

9 MATERIAIS E MÉTODOS: MATERIAIS: SWNTs – Carbon Nanotechnologies (USA) 1-pyrenebutanoic acid succinimidyl – Molecular Probes (USA) HS(CH 2 ) 11 (OCH 2 CH 2 ) 6 OCH 2 NH 2 (HS-OEG 6 -NH 2 ) e HS(CH 2 ) 11 (OCH 2 CH 2 ) 3 OH(HS-OEG 3 -OH) – Cos-Biotech (Korea) PSA-ACT complex and PSA-ACT complex monoclonal antibody (PSA-ACT mAb) – Fitzgerald Industries International Inc. (USA). 1-Pyrenbutanol (PB), human serum, bovine serum albumin (BSA) and other chemical reagents - Sigma–Aldrich (USA). Platinum wire - Tae Won Scientific Corporation (Korea). Silicon Isolators - Sigma–Aldrich. Deionized water – Human Corporation (Korea)

10 10 FABRICAÇÃO DOS DISPOSITIVOS CNT-FET Monocamadas auto-montadas de metil-termined octadecyltrichlorosilane em pastilhas de óxido de silício foram gerados por padronização fotoresistente através de fotolitografia Mergulha a pastilha em solução OTS por 3 minutos Remoção da PR com acetona

11 11 Os SWNT foi preparados pela dispersão de nanotubos de carbono purificado em 1,2-diclorobenzeno com ultra-som por 1 hora A pastilha de óxido de silício Mergulhada na solução SWNT (10s) Lavadas com 1,2-diclorobenzeno Secas com gás nitrogênio Esta etapa permitiu os SWNTs serem adsorvidos em regiões descoberta de SiO 2

12 12 Após a montagem do CNT os eletrodos foram confeccionados e o processo de fotolitografia foi realizado. Para fazer a câmara de reação, um isolador de silicone foi anexado

13 13 PREPARAÇÃO DA SUPERFÍCIE DO CNT PARA A DETECÇÃO EM SOLUÇÃO

14 14 Para a funcionalização da superfície não covalente do CNT, os dispositivos CNT-FET foram incubados com soluções preparadas por 2h em temperatura ambiente, seguido por lavagem com metanol para lavar qualquer reagente em excesso. Para a imobilização covalente de proteínas do receptor na superfície da CNT, cada dispositivo CNT-FET foram expostos a 20µg/ml de PSA-ACT mAb em 10 mM de tampão PBS (pH 7,4) durante a noite em temperatura ambiente. A não-reação dos grupos funcionais foram bloqueados por 100 mM de etanolamina e cuidadosamente lavados com água deionizada por 6 h, e depois secos com gás nitrogênio.

15 15 PREPARAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DE OURO As nanopartículas de ouro (AuNPs) foram sintetizados por redução de citrato de sódio de uma solução aquosa HAuCl 4 Um volume de 0,5 ml de 50 mM HAuCl 4 foi aquecido e 2,5 ml de solução de citrato trissódico foi adicionado à solução em ebulição sob agitação vigorosa A solução foi fervida mais 15 min para completar a redução dos íons de ouro e então agitada por mais 15 minutos e resfriadas à temperatura ambiente

16 16 Após a AuNPs foram tampadas com uma relação molar de 1:10 HS-OEG6- NH2: HS-OEG3-OH- através da mistura de 9,0 ml da solução de ouro e 1,0 ml de uma solução etanólica de HS-OEG6-NH2:HS-OEG3-OH para produzir uma concentração efetiva de 0,5mM de HS-OEG6-NH2:HS-OEG3-OH Agitação por 6 horas à temperatura ambiente para a separação dos produtos químicos desvinculados das AuNPs Em seguida, o sedimento foi ressuspandido em 10 mM de tampão PBS As AuNPs funcionalizadas foram armazenadas em 10 mM de tampão PBS a 4ºC para experimentos posteriores

17 17 MEDIÇÃO ELÉTRICA As propriedades elétricas dos dispositivos CNT-FET durante a introdução das proteínas-alvo foram medidos por um sistema de caracterização de semicondutores conectado a uma estação de teste que faz o contato elétrico com os eletrodos de fonte e dreno do CNT-FET. Os dispositivos foram estabilizados em solução tampão 10 mM PBS (pH 7,4), e um fio de platina foi inserida como um eletrodo de porta (VG). Para o controle do sinal elétrico foi introduzida 5,0μl de solução tampão Uma substância com concentrações crescentes foi introduzida na câmara usando volumes de amostra de 5,0 μl. Para analisar a sensibilidade, especificidade e seletividade do dispositivo CNT- FET, o complexo PSA-ACT foi diluído com 10 mg/ml de soro humano para produzir concentrações de 0,1, 1, 10, 50, 100 e 500 ng / ml.

18 18 Resultados e discussão Layout do dispositivo de e caracterização elétrica do CNT-FET As imagens detalhadas de dispositivo CNT-FET são mostrados na fig. 1A

19 19 Neste método, os padrões de rede CNT foram formados diretamente sobre uma superfície de óxido de silício, sem moléculas ligantes e foram usadas como canal para FETs. A relação on-off foi baixa, porque a rede SWNT foi composta por dois semicondutores e nanotubos de carbono metálico. No entanto, o CNT-FET tem vantagens significativas para aplicações em sensores. Em primeiro lugar, uma vez que o método de fabricação não usa todas as moléculas vinculador, o possível sinal contaminação foi minimizado pelas moléculas vinculador.

20 20 Além disso, neste processo, como nanotubos de carbono foram adsorvidos sobre a superfície de óxido de silício, a superfície tornou-se formadoras das camadas não- polares de SWNT múltiplos. As propriedades elétricas da CNT-FETs foram medidos em tempo real na temperatura ambiente. A configuração experimental mostrado na figura. 2 (a) indica que o campo elétrico que foi aplicado aos CNT, através do eletrodo de referência (gate), em relação à fonte e dreno.

21 21 As características da CNT-FET na solução tampão foram investigados, como mostrado na figura 2(b). A CNT-FET apresentou aumento na corrente dreno-fonte com tendencia ao gate negativo, mas diminuia com o aumento da polarização de gate positivamente no sentido dreno-fonte de 50 mV. Este resultado indicou que este aparelho apresentou características do tipo p no tampão PBS.

22 22 Caracterização da superfície do nanotubo de carbono modificado com linkers e espaçadores No sistema biosensor geral, a sensibilidade do sinal específico está intimamente relacionado com o padrão do ligante imobilizado na superfície do sensor. A sensibilidade do dispositivo CNT-FET pode ser reforçada através da otimização da densidade superficial do ligante; Para obter uma densidade de superfície ideal do ligante, o espaço entre ligantes é importante para as proteínas alvo acessarem facilmente os receptores imobilizados. Assim, foi introduzido o design de superfície: espaçador (PASE: PB) na superfície do CNT para melhorar a acessibilidade do alvo

23 23 Para confirmar o padrão de imobilização dos receptores dependendo da relação molar de vinculador e espaçador, cerca de 12 nm AuNPs modificadas com grupos amina e hidroxila foram imobilizados na superfície CNT tratadas com produtos químicos, em vez de receptores PSA-ACT mAb

24 24 Figura. 3 mostra que AuNPs como receptores se ligam fortemente às linkers imobilizadas na superfície do CNT, e que a distância entre os receptores, por área, também é diferente, com uma razão molar de ligador ao receptor. Quando o vinculador foi tratado sem espaçador na superfície do CNT, nanopartículas compactas de Au foram imobilizadas (Surface A). Além disso, ao aumentar a razão molar do espaçador, a distância entre AuNPs aumentou (Surface B, C e D). A imagem de MEV do experimento de controle sem qualquer tratamento prévio, mostrou uma falta de AuNPs, como é o caso da superfície E, no qual a superfície CNT foi tratado apenas com PB (Surface E na Fig. 3. ). Portanto, como mostrado nos resultados acima, o controle da distância entre os receptores usando o espaçador pode ser afirmado.

25 25 Fig. 4 mostra a corrente de dreno versus característica gate de voltagem do aparelho CNT-FET fixa a 0,01 V, antes e após as modificações químicas e anticorpos na superfície do CNT puro. Observamos, também, a partir da curva de CNT puro que o (IDS) foi suprimida com o aumento positivo de VG, indicando uma caractiristica FETs tipo-p. Após PASE: PB solução mistura e solução espaçador só foram tratados na superfície do CNT puro por 2 h, a condutância do dispositivo CNT-FET foi alterado em ambos os casos, indicando que o ligador selecionado e o espaçador tiveram sucesso quando imobilizado na superfície do CNT.

26 26 Então, a superfície modificada CNT foi exposta a 20 mg/ml de PSA ACT-mAb em tampão PBS durante a noite. A condutância no caso do dispositivo CNT-FET modificada com PASE PB foi alterado. No entanto, no caso de um dispositivo CNT-FET modificado só com o espaçador, a mudança na condutância não foi observada, indicando que o vinculador PASE selecionado efetivamente, imobiliza receptores para a detecção de proteínas-alvo. Além disso, o spacer PB conseguiu bloquear a ligação não específica na superfície CNT. Portanto, PASE e PB são de uteis para a estabilização da superfície do CNT.

27 27 Detecção do complexo PSA-ACT no soro humano pelo NTC-FET modificado com um ligante e um espaçador

28 28 Detecção do PSA-ACT Resposta do NTC-FET modificado somente com ligantes. Não houve alteração da condutância mesmo com adição de 500ng do PSA-ACT, isto pode ser explicado porque o complexo PSA-ACT não se aproxima da superfície do NTC dentro da distância do comprimento de Debye.

29 29 Detecção do PSA-ACT Para resolver esse problema, introduziram um espaçador. Na proporção 1:1 de ligante/espaçador a alteração da condutância ocorreu quando o NTC-FET reagiu com 500ng/ml. Como a distância entre os receptores aumentou devido a adição de espaçadores na superfície do NTC, as proteínas carregadas negativamente podem aproximar- se dentro da distância do comprimento de Debye, afetando a condutância com maior facilidade. Entretanto a concentração mínima detectável do biossensor era ainda muito elevada.

30 30 Detecção do PSA-ACT Para obter melhor sensibilidade de detecção, a superfície do NTC foi funcionalizada na razão 1:3 ligante/espaçador. A condutância aumentou gradualmente após a exposição dos NTC-FET ao complexo PSA-ACT em concentrações crescentes.

31 31 Detecção do PSA-ACT Modificando a superfície na concentração 1:9, a condutância aumentou gradualmente após a exposição ao complexo PSA-ACT em concentrações frequentes 1,0-50 ng/ml, exceto para concentração 0,1 – 50 ng/ml de PSA-ACT. A concentração mínima detectada foi a mesma que foi para o NCT-FET modificado 1:3 e o sistema 1:9. Este resultado mostra que a relação do sistema detectado na proporção 1:9 foi maior, indicando melhor sensibilidade deste biosenssor.

32 32 Conclusões Biosensores sensíveis e específicos. Esta estratégia possibilitou a construção de sistemas de biossensor CNT- FET baseado reações antígeno-anticorpo. Foi realizada a modificação da superfície dos NTC-FET, com diferentes razões molares de ligantes e espaçadores, o que melhorou a sensibilidade dos biossensores. O método foi capaz de reduzir o limite de detecção para uma concentração de proteína de 1,0 ng/ml,. A estratégia da modificação da superfície CNT usando um espaçador na superfície dos biossensores pode servir como um grande avanço, permitindo várias aplicações importantes em proteômica e diagnósticos médicos. 32