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Uso de Células Tronco na Terapia Celular: Fundamentos e Perspectivas Marco Antonio Zago Pro-Reitor de Pesquisa da USP Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade.

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1 Uso de Células Tronco na Terapia Celular: Fundamentos e Perspectivas Marco Antonio Zago Pro-Reitor de Pesquisa da USP Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Ribeirão Preto – Outubro 2010

2 I have seen a medicine Thats able to breathe life into a stone, Quicken a rock, and make you dance canary With spritely fire and motion, whose simple touch Is powerful to araise King Pippen, nay, To give great Charlemain a pen in 's hand And write to her a love-line. W. Shakespeare All's Well That Ends Well A Miraculous Medicine Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

3 Cientistas britânicos pretendem usar células tronco para tratar uma forma comum de cegueira Pacientes cegos por queimaduras químicas recuperaram a visão após implante de células tronco em centro italiano Células tronco para a cegueira Notícias na Imprensa Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

4 Degeneração Macular Relacionada à Idade Forma úmidaProliferação vascular Forma secaAtrofia 10% casosMais grave Várias formas de tratamento Não há tratamento90% casos Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

5 Fibroblastos humanos iPS OCT4, SOX2, NANOG, LIN28 NeuralCartilagem Epitélio Intestinal iPSEPR Epitélio Pigmentado Retiniano Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

6 Fibroblastos humanos iPS OCT4, SOX2, NANOG, LIN28 EPR Epitélio Pigmentado Retiniano NeuralCartilagem Epitélio Intestinal Royal College of Surgeons dystrophic rats Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

7 Limbo contém as células tronco que repõem as células da superfície da córnea Córnea Conjuntiva Limbo Córnea e células tronco Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

8 Limbo contém as células tronco que repõem as células da superfície da córnea Córnea Conjuntiva Limbo Córnea e células tronco Deficiência parcial Destruição (queimadura) Invasão da córnea pelo epitélio conjuntival Neovascularização Inflamação Cicatrização Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

9 Limbal Stem-Cell Therapy and Long-Term Corneal Regeneration Sucesso82 (77%) Sucesso parcial14 (13%) Insucesso11 (10%) p63-bright cells: holoclone forming cells in culture Pacientes com perda de visão por queimadura da córnea Células do limbo contralateral obtidas por biópsia, cultivadas e implantadas Antes Depois NEJ Medicine 363:147, 2010 Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

10 Cientistas brasileiros testam o uso de células-tronco contra cegueira PESQUISA O Globo RIO – O uso de células-tronco pode ser uma esperança para o tratamento de problemas graves de visão, como a retinose pigmentar, que leva à cegueria..... Se der certo para retinose pigmentar – estima-se que no Brasil 40 mil pessoas sofrem desse mal – o tratamento poderá ser testado em outras doenças, como a degeneração macular relacionada com a idade (DMRI) e a retinopatia diabética..... Daí a idéia de retirar as células da própria medula óssea desses pacientes, que em seguida foram processadas e injetadas no vítreo do globo ocular. Células tronco hematopoéticas Células tronco mesenquimais Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

11 Bone Marrow Peripheral Blood Umbilical Cord Ficoll-Hypaque gradient Metho-Cult GF- H4434 medium 14 days 37 o C 5% CO 2 Colonies Mono- nuclears Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

12 CFU-GM BFU-E Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

13 CFU-GEMM CFU-GM Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

14 - MEM 20% Fetal Calf Serum Mono- nuclears Bone Marrow Umbilical Vein Ficoll-Hypaque gradient Weekly Trypsin Detach cells 14 days 72 hours Remove non-adherent cells

15 Insulina Dexametasone Indometacina Diferenciação Adipocítica Dexametasone Ácido ascórbico Diferenciação Osteoblástica

16 Tecidos Adultos Fontes de MSC em Humanos Tecidos Fetais Placenta Medula óssea Tecido adiposo Veias e artérias Medula óssea fetal Fígado fetal Sague periférico fetal Sangue de cordão umbilical Veia de cordão umbilical Gônadas Células fetais Células maternas Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

17 MSC de veia umbilical MSC Sudan II Fosfatase Alcalina Von Kossa H.E. Colágeno II

18 mammalian Target of Rapamycin mTOR (FRAP1) Serina/treonina proteino-cinase Síntese Ciclina D1 Proliferação celular Angiogênse Proteínas angiogênicas TSC1 e TSC2 Ativa metabolismo Deleção de PTENSíndrome mielodisplásica Leucemias Inibidores de mTOR rapanalogs Tratamento de câncer PTEN regulador (inibidor) de mTOR mTOR Inibidores de mTOR Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

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20 Células-tronco: Propriedades e Fontes

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22

23 Blastocisto

24 Todos os tecidos do adulto

25 Células-tronco Embrionárias Lygia V. Pereira Instituto de Biologia USP adipócitos epitélio neurônios fibras musculares CT embrionários blastocisto * * corpo embrióide Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

26 Propriedade Fundamental das Células-Tronco Divisão Assimétrica Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

27

28 Célula-tronco Instestinal Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

29 TrofoectodermaEndoderma Progenitores Cels Maduras Embrião +Gata4/5+Cdx2 Células BMacrófagos +Cebp Célula Acinar Célula +Pdx1, Ng3n, Mafa MúsculosFibroblastos +Myod Progenitores Hematopoéticos -Pax5 Reprogramação de Células com Base em Fatores de Transcrição Massa Interna CT Embrionária +Oct3/4 +Sox2 +Klf4 (+cMyc) Massa Interna CT Embrionária iPS Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

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31 Takahashi & Yamanaka Teratomas derivados de iPS Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

32 TrofoectodermaEndoderma Progenitores Cels Maduras Embrião +Gata4/5+Cdx2 Células BMacrófagos +Cebp Célula Acinar Célula +Pdx1, Ng3n, Mafa MúsculosFibroblastos +Myod Progenitores Hematopoéticos -Pax5 Reprogramação de Células com Base em Fatores de Transcrição Massa Interna CT Embrionária +Oct3/4 +Sox2 +Klf4 (+cMyc) Massa Interna CT Embrionária iPS Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

33 Células Tronco Células tronco pluripotentes células tronco embrionárias (blastocisto 4-5 dias) células embrionárias germinais (feto 5-9 semanas) iPS (induced pluripotent stem cell) Células tronco de adultos medula óssea vasos músculos esqueléticos fígado cérebro dentes intestino pele coração Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

34 Uso Terapêutico

35 Diabete melito Infarto do miocárdio Miocardiopatias Cirrose hepática Câncer Grandes defeitos ósseos Doença de Parkinson Doenças auto-imunes Distrofias musculares Cegueria Doenças hematológicas Doenças metabólicas Doenças potencialmente tratáveis com terapia celular com células-tronco Doenças ósteo-articulares Fibrose pulmonar Defeitos da face Vasculopatia periférica D. vascular cerebral Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

36 Diabete melito Infarto do miocárdio Miocardiopatias Cirrose hepática Câncer Grandes defeitos ósseos Doença de Parkinson Doenças auto-imunes Distrofias musculares Cegueira Doenças hematológicas Doenças metabólicas Doenças atualmente tratáveis com terapia celular com células-tronco Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

37 Registros de Trials Clínicos

38 The registration of all interventional trials is a scientific, ethical and moral responsibility. There is a need to ensure that decisions about health care are informed by all of the available evidence It is difficult to make informed decisions if publication bias and selective reporting are present The Declaration of Helsinki Every clinical trial must be registered in a publicly accessible database before recruitment of the first subject.

39 Obligation to Register Clinical Trials The ICMJE believes that it is important to foster a comprehensive, publicly available database of clinical trials. International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE) Trials Results and the Media Researchers will not publicize their work while their manuscript is under consideration or awaiting publication. Very little medical research has such clear and urgently important clinical implications for the publics health that the news must be released before full publication in a journal.

40 2.641 Studies with the tag: stem cells 2.418: hematopoietic stem cells Clinical Trials.gov

41 Células tronco embrionários Células iPS Células tronco adultas tecido-específica Estratégias de Terapia com Células Tronco Células totipotentes Isolamento Enriquecimento, cultura Injeção/transplante Fonte de Células Estratégia Cultura Diferenciação Injeção/transplante Medula óssea Pele Olho S. nervoso Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

42 Nature 410:701, 2000 Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium Donald Orlic, Jan Kajstura, Stefano Chimenti, Igor Jaloniuk, Stacie M. Anderson, Baosheng Li, James Pickel, Ronald McKay, Bernardo Nadal-Ginardi, David M. Bodline, Annarosa Leri & Piero Anversa mm Hg LVEDP Transplanted cells Infarcted myocardium Unknown molecular signal(s) Cell migration to damaged area Proliferation and differentiation Cytoplasmic proteins Cardiac myosin -Sarcomeric actin Connexin 43 Nuclear proteins Csx/Nkx2.5 MEF2 GATA-4 Functional competence C Infarction + BM cells Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

43 Transdiferenciação: Fusão Contaminação

44 Transdiferenciação: Fusão Contaminação

45 Pesquisa Básica Pesquisa Translacional Pesquisa Clínica Evidência Médica Sólida Mudança da Abordagem Médica Resultados Avaliação Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

46 Abordagem que modifica significativamente o desfecho clínio em relação aos tratamentos existentes estabelecidos Resultados são obtidos consistentemente por diferentes observadores Trials com resultados convincentes Vantagem adicional é suficientemente grande para sobrepujar os riscos adicionais Evidência Médica Sólida Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

47 Não, não há evidência Há evidência médica sólida, não controvertida, que qualquer outra forma de terapia celular com células-tronco adultas seja vantajosa em um ambiente clínico? Exceto para os tratamentos com base em transplante de células tronco hematopoéticas, tratamento de lesões da córnea e o uso de MSC como imunomoduladora, Evidência Médica Sólida Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

48 Terapia Celular: Estratégias Substituição do tecido doente ou destruído Células tronco tecido-específicas Transplante de medula óssea Pele cultivada Transplante de células pancreáticas Células tronco embrionárias ou células iPS Células de m. óssea: regeneração de outros órgãos Imunoterapia + Transplante autólogo Efeito imuno-modulador Diabete melito tipo I Mesenquimais: osso e cartilagem Cels. tronco mesenquimais

49 Precursores hematopoéticas não originam cardio-miócitos MSC não originam cardiomócitos Derivadas de tecido hematopoético (linhagem monocítica) fundem-se com hepatócitos, cardiomiócitos, células de Purkinje, CT intestinais Precursoras hematopoéticas podem se incorporar no endotélio MSC são imunossupressoras MSC poderiam reduzir reação inflamatória Precursoras da medula óssea poderiam secretar substâncias bioativas localmente Terapia Celular de Doenças Cardíacas Células Hematopoéticas

50 Heart Disease Myocardial Ischemia Myocardial Infarction Coronary Disease Heart Failure Cardiomyopathies Hypertension Peripheral Vascular Disease Stroke Diabetic Angiopathies Intracranial Hemorrhages C No Condition Stem Cell All Evidence* Clinical Trials *Evidence = published results of convincing double-blind trials C = contradictory or non-reproducible results Registered Clinical Trials with Stem Cells

51 Graft-versus-Host Disease Heart Disease Myocardial Ischemia Heart Failure Autoimmune Diseases Bone Diseases Diabetes Mellitus Peripheral Vascular Disease Stroke Intestinal Disease All studies C No No No Condition MSC Stem Cells Evidence* Clinical Trials *Evidence = published results of convincing double-blind trials C = contradictory or non-reproducible results Registered Clinical Trials with MSC

52 Conclusion: In patients with AMI and impaired LVEF, treatment with BM cells does not lead to a significant improvement of LVEF or volumes.

53 N= 20N= 46N= 51

54 BOOST Janssens ASTAMI REPAIR-AMI Follow-up (mos) Control/placebo Treatment Improvement LVEF C/P 51-54% 47-49% 43-49% 47-50% Treatment 50-56% 49-52% 41-49% 48-54% Mortality + Reinfarct C/P 3% 0% 0% 6% Treatment 3% 6% 2% 2% Randomized Trials with BMC – Acute Myocardial Infarction

55

56 EF 3-4% Changes observed with cell-therapy are in the range observed with other therapies

57 CaptoprilRamipril Captopril Valsantan Carvedilol

58 Changes in functional and morphometric parameters of LV In the range observed with: Reperfusion therapy Beta-blockers Interventions in the renin-angiotensin pathway Intracoronary Transplantation of PB or BM derived cells Increase in LVEF = 3-4%

59 Efeito Mecânico da Destruição Ventricular no Infarto do Miocárdio Choque cardiogênico40% Insuficiência cardíaca1 bilhão miócitos 25% Destruição celular Infarto Ventrículo Esquerdo 200 g = 4 x 10 9 miócitos Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

60 Regeneração Cardíaca Verdadeira Restauração 1 x 10 9 miócitos Inserção nos sítios adequados Junção eletromecânica Contração síncrona com o restante do miocárdio Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

61 Células da medula óssea não substituem cardiomiócitos Medula Óssea a Recipiente Doador LacZ Lesão Purificação Células LacZ-positivas Fibrose Cardiomiócito (sem LacZ) b Doador GFP Recipiente Transfusão direta Células GFP-positivas Fibrose Cardiomiócito (sem GFP)

62 Cardiomiócitos Mioblastos esqueléticos Músculos lisos Fibroblastos Precursores endoteliais Medula óssea (total ou frações) Células-tronco mesenquimais Fontes de Células para Terapia de Doenças Cardíacas Sem sucesso Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

63 Fontes de Células para Terapia de Doenças Cardíacas Perspectivas Progenitores miocárdicos residentes Células-tronco embrionárias Injeção de fatores de crescimento Transplante de células modificadas (terapia gênica) iPS com diferenciação cardíaca Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

64 iPS recapitula a propensão cardiogênica in utero Nelson et al, Circulation, 2009 Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

65 iPS restaura função do miocárdio após infarto experimental Nelson et al, Circulation, 2009 Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

66 Heart reconstruction with on-demand cardiovasculogenesis Nuclear reprogramming offers a revolutionary strategy for embryo-independent derivation of pluripotent stem cells form an ordinary adult source. iPS reverse cell fate to reset embryonic-like potential of somatic tissue. In this way, iPS have attained functions of natural embryonic stem cells to produce all tissue types and develop the complete organism. The proof-of-principle study here establishes the practical application of bioengineered stem cells to respond to the ischemic myocardium and heal the damaged areas with iPS- derived integrated functional tissue. Nelson et al, Circulation, 2009 Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

67 ISSCR Recommendations

68 Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

69 Responsability for conduct 2 Cell processing and manufactures 8 Preclinical studies 9 Clinical research14 Stem-cell based medical innovation 1 Considerations of social justice 5 Ongoing review of guidelines 1 40 Chapter Guidelines Total Guidelines for the Clinical Translation of Stem Cells Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

70 Recommendation 21 All studies involving clinical applications of stem cells must be subject to independent review, approval, and ongoing monitoring by human subjects research oversight bodies with supplemental appropriate expertise to evaluate the unique aspects of stem cell research and its application in a variety of clinical disciplines. This review and oversight process must be independent of the investigator regardless of whether it occurs at the institutional, regional or national level, and regardless of whether investigators employ the services of a contract research organization. Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

71 Recommendation 22 In countries where there is no official national regulatory body, the ISSCR strongly encourages government to develop a regulatory competence at the national, regional, or local level to monitor interventions with stem-cell based products. The ISSCR will strive to provide professional advice to those governing bodies interested in building their own capacities for regulatory oversight. Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

72 Recommendation 26 Clinical research should compare new stem-cell based therapies against the best medical therapy currently available to the local population Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

73 Recommendation 33 Researchers should publish both positive and negative results and adverse events. To ensure the integrity of scientific information and to promote the highest standard of professional conduct, researchers should present their results at professional scientific conferences or in peer-reviewed scientific journals before reporting their research to the lay media or to patient advocacy groups and associations. Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

74 Recommendation 23 The peer review process for stem cell-based clinical trials should have appropriate expertise to evaluate (a) the in vitro and in vivo preclinical studies that form the basis for the clinical trial, and (b) the scientific underpinnings of the trial protocol, the adequacy of planned end-points, statistical considerations, and disease specific issues related to human subject protection. Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

75 Recommendation 25 A stem cell-based must aim at being clinically competitive or superior to existing therapies. If an efficacious therapy already exists, the risks associated with a stem cell-based approach must be low and must offer a potential advantage (for example, better functional outcome; single procedure versus life-long drug-therapy, reduction of long-term costs) Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

76 Perspectivas

77 Células Tronco Tecido-específicas Abordagens gerais Perspectivas para Terapias Inovadoras Reprogramação Nuclear (iPS) Transdiferenciação Manipulação Imunológica seguida de transplante de HSC Deficiências Enzimáticas: Terapia Substitutiva Manipulação Celular para Induzir ou Inibir a Expressão de Gene(s) Específico(s) Células Tronco Mesenquimais Aplicações Específicas ou Focalizadas Transdiferenciação Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

78 Isolamento em números significativos Indução mais fisiológica Obter a diferenciação correta Excluir células pluripotenciais Eficiência de indução Células Tronco Tecido Específicas iPS Terapias Inovadoras: os Gargalos Obter a célula ou a combinação correta Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

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