Fundamentos e Perspectivas Ribeirão Preto – Outubro 2010

Apresentação em tema: "Fundamentos e Perspectivas Ribeirão Preto – Outubro 2010"— Transcrição da apresentação:

1 Fundamentos e Perspectivas Ribeirão Preto – Outubro 2010
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Uso de Células Tronco na Terapia Celular: Fundamentos e Perspectivas Marco Antonio Zago Pro-Reitor de Pesquisa da USP Ribeirão Preto – Outubro 2010

2 A Miraculous Medicine I have seen a medicine
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo A Miraculous Medicine I have seen a medicine That’s able to breathe life into a stone, Quicken a rock, and make you dance canary With spritely fire and motion, whose simple touch Is powerful to araise King Pippen, nay, To give great Charlemain a pen in 's hand And write to her a love-line. W. Shakespeare All's Well That Ends Well

3 Células tronco para a cegueira
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Células tronco para a cegueira Notícias na Imprensa Cientistas britânicos pretendem usar células tronco para tratar uma forma comum de cegueira Pacientes cegos por queimaduras químicas recuperaram a visão após implante de células tronco em centro italiano

4 Degeneração Macular Relacionada à Idade
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Degeneração Macular Relacionada à Idade Forma “úmida” Proliferação vascular 10% casos Mais grave Várias formas de tratamento Forma “seca” Atrofia 90% casos Não há tratamento

5 Fibroblastos humanos iPS iPS EPR
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Fibroblastos humanos OCT4, SOX2, NANOG, LIN28 iPS iPS EPR Epitélio Pigmentado Retiniano Neural Cartilagem Epitélio Intestinal

6 Royal College of Surgeons
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Fibroblastos humanos OCT4, SOX2, NANOG, LIN28 iPS iPS EPR Neural Cartilagem Epitélio Intestinal Epitélio Pigmentado Retiniano Royal College of Surgeons dystrophic rats

7 Córnea e células tronco
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Córnea e células tronco Limbo contém as células tronco que repõem as células da superfície da córnea Conjuntiva Limbo Córnea

8 Córnea e células tronco
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Córnea e células tronco Limbo contém as células tronco que repõem as células da superfície da córnea Conjuntiva Limbo Córnea Neovascularização Inflamação Cicatrização Deficiência parcial Destruição (queimadura) Invasão da córnea pelo epitélio conjuntival

9 Limbal Stem-Cell Therapy and Long-Term Corneal Regeneration
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Limbal Stem-Cell Therapy and Long-Term Corneal Regeneration Pacientes com perda de visão por queimadura da córnea Células do limbo contralateral obtidas por biópsia, cultivadas e implantadas Antes Depois NEJ Medicine 363:147, 2010 Sucesso 82 (77%) Sucesso parcial 14 (13%) Insucesso 11 (10%) p63-bright cells: holoclone forming cells in culture

10 Cientistas brasileiros testam o uso de células-tronco contra cegueira
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo PESQUISA Cientistas brasileiros testam o uso de células-tronco contra cegueira O Globo RIO – O uso de células-tronco pode ser uma esperança para o tratamento de problemas graves de visão, como a retinose pigmentar, que leva à cegueria Se der certo para retinose pigmentar – estima-se que no Brasil 40 mil pessoas sofrem desse mal – o tratamento poderá ser testado em outras doenças, como a degeneração macular relacionada com a idade (DMRI) e a retinopatia diabética. .... Daí a idéia de retirar as células da própria medula óssea desses pacientes, que em seguida foram processadas e injetadas no vítreo do globo ocular. Células tronco hematopoéticas Células tronco mesenquimais

11 Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Metho-Cult GF-H4434 medium 14 days 37o C 5% CO2 Colonies Mono- nuclears Ficoll-Hypaque gradient Bone Marrow Peripheral Blood Umbilical Cord

12 Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
BFU-E BFU-E CFU-GM

13 Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
CFU-GM CFU-GEMM

14 Ficoll-Hypaque gradient
 - MEM 20% Fetal Calf Serum Mono- nuclears Bone Marrow Umbilical Vein Ficoll-Hypaque gradient 72 hours Remove non-adherent cells Weekly Trypsin Detach cells 14 days

15 Diferenciação Osteoblástica Diferenciação Adipocítica
Dexametasone Ácido ascórbico Diferenciação Osteoblástica Insulina Dexametasone Indometacina Diferenciação Adipocítica

16 Fontes de MSC em Humanos
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Fontes de MSC em Humanos Tecidos Adultos Medula óssea Tecido adiposo Veias e artérias Tecidos Fetais Medula óssea fetal Fígado fetal Sague periférico fetal Sangue de cordão umbilical Veia de cordão umbilical Gônadas Placenta Células fetais Células maternas

17 MSC de veia umbilical MSC Sudan II Fosfatase Alcalina Von Kossa H.E.
Colágeno II

18 Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
mTOR Síntese Ciclina D1 mTOR (FRAP1) Proliferação celular mammalian Target of Rapamycin Proteínas angiogênicas Angiogênse Serina/treonina proteino-cinase TSC1 e TSC2 Ativa metabolismo Inibidores de mTOR Inibidores de mTOR rapanalogs Tratamento de câncer PTEN regulador (inibidor) de mTOR Deleção de PTEN Síndrome mielodisplásica Leucemias

19 Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

20 Células-tronco: Propriedades e Fontes

21

22

23 Blastocisto

24 Todos os tecidos do adulto

25 Células-tronco Embrionárias
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Células-tronco Embrionárias CT embrionários blastocisto * corpo embrióide adipócitos epitélio neurônios fibras musculares Lygia V. Pereira Instituto de Biologia USP

26 Propriedade Fundamental das Células-Tronco
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Propriedade Fundamental das Células-Tronco Divisão Assimétrica

27 Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

28 Célula-tronco Instestinal
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Célula-tronco Instestinal

29 Reprogramação de Células com Base em Fatores de Transcrição
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Reprogramação de Células com Base em Fatores de Transcrição Embrião +Oct3/4 +Sox2 +Klf4 (+cMyc) Massa Interna CT Embrionária iPS Massa Interna CT Embrionária +Gata4/5 +Cdx2 Endoderma Trofoectoderma Progenitores Hematopoéticos -Pax5 Progenitores Células B Macrófagos +Cebp Músculos Fibroblastos +Myod Cels Maduras Célula Acinar Célula  +Pdx1, Ng3n, Mafa

30 Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

31 Teratomas derivados de iPS
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Teratomas derivados de iPS Takahashi & Yamanaka

32 Reprogramação de Células com Base em Fatores de Transcrição
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Reprogramação de Células com Base em Fatores de Transcrição Embrião +Oct3/4 +Sox2 +Klf4 (+cMyc) Massa Interna CT Embrionária iPS Massa Interna CT Embrionária +Gata4/5 +Cdx2 Endoderma Trofoectoderma Progenitores Hematopoéticos -Pax5 Progenitores Células B Macrófagos +Cebp Músculos Fibroblastos +Myod Cels Maduras Célula Acinar Célula  +Pdx1, Ng3n, Mafa

33 Células Tronco Células tronco pluripotentes Células tronco de adultos
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Células Tronco Células tronco pluripotentes células tronco embrionárias (blastocisto 4-5 dias) células embrionárias germinais (feto 5-9 semanas) iPS (induced pluripotent stem cell) Células tronco de adultos medula óssea vasos músculos esqueléticos fígado cérebro dentes intestino pele coração

34 Uso Terapêutico

35 Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Doenças potencialmente tratáveis com terapia celular com células-tronco Diabete melito Infarto do miocárdio Miocardiopatias Cirrose hepática Câncer Grandes defeitos ósseos Doença de Parkinson Doenças auto-imunes Distrofias musculares Cegueria Doenças hematológicas Doenças metabólicas Doenças ósteo-articulares Fibrose pulmonar Defeitos da face Vasculopatia periférica D. vascular cerebral

36 Doenças atualmente tratáveis com terapia celular com células-tronco
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Doenças atualmente tratáveis com terapia celular com células-tronco Diabete melito Infarto do miocárdio Miocardiopatias Cirrose hepática Câncer Grandes defeitos ósseos Doença de Parkinson Doenças auto-imunes Distrofias musculares Cegueira Doenças hematológicas Doenças metabólicas

37 Registros de Trials Clínicos

38 The Declaration of Helsinki
The registration of all interventional trials is a scientific, ethical and moral responsibility. There is a need to ensure that decisions about health care are informed by all of the available evidence It is difficult to make informed decisions if publication bias and selective reporting are present The Declaration of Helsinki Every clinical trial must be registered in a publicly accessible database before recruitment of the first subject.

39 International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE)
Obligation to Register Clinical Trials The ICMJE believes that it is important to foster a comprehensive, publicly available database of clinical trials. Trials Results and the Media Researchers will not publicize their work while their manuscript is under consideration or awaiting publication. Very little medical research has such clear and urgently important clinical implications for the public’s health that the news must be released before full publication in a journal.

40 2.641 Studies with the tag: stem cells 2.418: hematopoietic stem cells
Clinical Trials.gov

41 Estratégias de Terapia com Células Tronco
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Estratégias de Terapia com Células Tronco Fonte de Células Estratégia Células totipotentes Cultura Diferenciação Injeção/transplante Células tronco embrionários Células iPS Células tronco adultas tecido-específica Isolamento Enriquecimento, cultura Injeção/transplante Medula óssea Pele Olho S. nervoso

42 Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium Donald Orlic, Jan Kajstura, Stefano Chimenti, Igor Jaloniuk, Stacie M. Anderson, Baosheng Li, James Pickel, Ronald McKay, Bernardo Nadal-Ginardi, David M. Bodline, Annarosa Leri & Piero Anversa Nature 410:701, 2000 Transplanted cells Infarcted myocardium Unknown molecular signal(s) Cell migration to damaged area Proliferation and differentiation Cytoplasmic proteins Cardiac myosin -Sarcomeric actin Connexin 43 Nuclear proteins Csx/Nkx2.5 MEF2 GATA-4 Functional competence 40 30 20 10 mm Hg LVEDP C Infarction + BM cells

43 Transdiferenciação: Fusão Contaminação

44 Transdiferenciação: Fusão Contaminação

45 Evidência Médica Sólida
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Pesquisa Básica Pesquisa Translacional Pesquisa Clínica Evidência Médica Sólida Mudança da Abordagem Médica Resultados Avaliação

46 Evidência Médica Sólida
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Evidência Médica Sólida Trials com resultados convincentes Abordagem que modifica significativamente o desfecho clínio em relação aos tratamentos existentes estabelecidos Resultados são obtidos consistentemente por diferentes observadores Vantagem adicional é suficientemente grande para sobrepujar os riscos adicionais

47 Evidência Médica Sólida
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Evidência Médica Sólida Exceto para os tratamentos com base em transplante de células tronco hematopoéticas, tratamento de lesões da córnea e o uso de MSC como imunomoduladora, Há evidência médica sólida, não controvertida, que qualquer outra forma de terapia celular com células-tronco adultas seja vantajosa em um ambiente clínico? Não, não há evidência

48 Terapia Celular: Estratégias
Substituição do tecido doente ou destruído Células tronco tecido-específicas Transplante de medula óssea Transplante de células pancreáticas Mesenquimais: osso e cartilagem Pele cultivada Células tronco embrionárias ou células iPS Células de m. óssea: regeneração de outros órgãos Imunoterapia + Transplante autólogo Diabete melito tipo I Efeito imuno-modulador Cels. tronco mesenquimais

49 Terapia Celular de Doenças Cardíacas Células Hematopoéticas
Precursores hematopoéticas não originam cardio-miócitos MSC não originam cardiomócitos Derivadas de tecido hematopoético (linhagem monocítica) fundem-se com hepatócitos, cardiomiócitos, células de Purkinje, CT intestinais Precursoras hematopoéticas podem se incorporar no endotélio MSC são imunossupressoras MSC poderiam reduzir reação inflamatória Precursoras da medula óssea poderiam secretar substâncias bioativas localmente

50 Registered Clinical Trials with “Stem Cells”
Condition Stem Cell All Evidence* Clinical Trials Heart Disease Myocardial Ischemia Myocardial Infarction Coronary Disease Heart Failure Cardiomyopathies Hypertension 127 101 62 44 36 20 9 4.489 2.010 631 1.433 934 218 2.218 C No Peripheral Vascular Disease Stroke Diabetic Angiopathies Intracranial Hemorrhages 17 13 3 1 272 887 226 119 No *Evidence = published results of convincing double-blind trials C = contradictory or non-reproducible results

51 Registered Clinical Trials with MSC
Condition MSC Stem Cells Evidence* Clinical Trials Graft-versus-Host Disease Heart Disease Myocardial Ischemia Heart Failure Autoimmune Diseases Bone Diseases Diabetes Mellitus 2 15 8 7 2 216 127 101 36 51 23 13 C No Peripheral Vascular Disease Stroke Intestinal Disease All studies 1 5 82 17 13 35 2.641 No *Evidence = published results of convincing double-blind trials C = contradictory or non-reproducible results

52 Conclusion: In patients with AMI and impaired LVEF, treatment with BM cells does not lead to a significant improvement of LVEF or volumes.

53 N= 20 N= 46 N= 51

54 Randomized Trials with BMC – Acute Myocardial Infarction
BOOST Janssens ASTAMI REPAIR-AMI Follow-up (mos) Control/placebo Treatment Improvement LVEF C/P % % % % Treatment % % % % Mortality + Reinfarct C/P % % 0% % Treatment 3% % 2% %

55

56 Changes observed with cell-therapy are in the range observed with other therapies
↑EF 3-4%

57 Captopril Valsantan Captopril Ramipril Carvedilol

58 Intracoronary Transplantation of PB or BM derived cells
Increase in LVEF = 3-4% Changes in functional and morphometric parameters of LV In the range observed with: Reperfusion therapy Beta-blockers Interventions in the renin-angiotensin pathway

59 Efeito Mecânico da Destruição Ventricular no Infarto do Miocárdio
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Efeito Mecânico da Destruição Ventricular no Infarto do Miocárdio Ventrículo Esquerdo 200 g = 4 x 109 miócitos Destruição celular Infarto Insuficiência cardíaca 1 bilhão miócitos 25% Choque cardiogênico 40%

60 Regeneração Cardíaca Verdadeira
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Regeneração Cardíaca Verdadeira Restauração 1 x 109 miócitos Inserção nos sítios adequados Junção eletromecânica Contração síncrona com o restante do miocárdio

61 a b Células da medula óssea não substituem cardiomiócitos Purificação
Células LacZ-positivas Fibrose Medula Óssea Doador LacZ Lesão Recipiente Cardiomiócito (sem LacZ) b Células GFP-positivas Fibrose Doador GFP Transfusão direta Cardiomiócito (sem GFP) Recipiente

62 Fontes de Células para Terapia de Doenças Cardíacas
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Fontes de Células para Terapia de Doenças Cardíacas Sem sucesso Cardiomiócitos Mioblastos esqueléticos Músculos lisos Fibroblastos Precursores endoteliais Medula óssea (total ou frações) Células-tronco mesenquimais

63 Fontes de Células para Terapia de Doenças Cardíacas
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Fontes de Células para Terapia de Doenças Cardíacas Perspectivas Progenitores miocárdicos residentes Células-tronco embrionárias Injeção de fatores de crescimento Transplante de células modificadas (terapia gênica) iPS com diferenciação cardíaca

64 iPS recapitula a propensão cardiogênica in utero
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo iPS recapitula a propensão cardiogênica in utero Nelson et al, Circulation, 2009

65 iPS restaura função do miocárdio após infarto experimental
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo iPS restaura função do miocárdio após infarto experimental Nelson et al, Circulation, 2009

66 Heart reconstruction with on-demand cardiovasculogenesis
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Heart reconstruction with on-demand cardiovasculogenesis Nuclear reprogramming offers a revolutionary strategy for embryo-independent derivation of pluripotent stem cells form an ordinary adult source. iPS reverse cell fate to reset embryonic-like potential of somatic tissue. In this way, iPS have attained functions of natural embryonic stem cells to produce all tissue types and develop the complete organism. The proof-of-principle study here establishes the practical application of bioengineered stem cells to respond to the ischemic myocardium and heal the damaged areas with iPS-derived integrated functional tissue. Nelson et al, Circulation, 2009

67 ISSCR Recommendations

68 Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo

69 Guidelines for the Clinical Translation of Stem Cells
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Guidelines for the Clinical Translation of Stem Cells Responsability for conduct 2 Cell processing and manufactures 8 Preclinical studies 9 Clinical research 14 Stem-cell based medical innovation 1 Considerations of social justice 5 Ongoing review of guidelines 40 Chapter Guidelines Total

70 Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Recommendation 21 All studies involving clinical applications of stem cells must be subject to independent review, approval, and ongoing monitoring by human subjects research oversight bodies with supplemental appropriate expertise to evaluate the unique aspects of stem cell research and its application in a variety of clinical disciplines. This review and oversight process must be independent of the investigator regardless of whether it occurs at the institutional, regional or national level, and regardless of whether investigators employ the services of a contract research organization.

71 Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Recommendation 22 In countries where there is no official national regulatory body, the ISSCR strongly encourages government to develop a regulatory competence at the national, regional, or local level to monitor interventions with stem-cell based products. The ISSCR will strive to provide professional advice to those governing bodies interested in building their own capacities for regulatory oversight.

72 Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Recommendation 26 Clinical research should compare new stem-cell based therapies against the best medical therapy currently available to the local population

73 Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Recommendation 33 Researchers should publish both positive and negative results and adverse events. To ensure the integrity of scientific information and to promote the highest standard of professional conduct, researchers should present their results at professional scientific conferences or in peer-reviewed scientific journals before reporting their research to the lay media or to patient advocacy groups and associations.

74 Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Recommendation 23 The peer review process for stem cell-based clinical trials should have appropriate expertise to evaluate (a) the in vitro and in vivo preclinical studies that form the basis for the clinical trial, and (b) the scientific underpinnings of the trial protocol, the adequacy of planned end-points, statistical considerations, and disease specific issues related to human subject protection.

75 Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo
Recommendation 25 A stem cell-based must aim at being clinically competitive or superior to existing therapies. If an efficacious therapy already exists, the risks associated with a stem cell-based approach must be low and must offer a potential advantage (for example, better functional outcome; single procedure versus life-long drug-therapy, reduction of long-term costs)

76 Perspectivas

77 Perspectivas para Terapias Inovadoras
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Perspectivas para Terapias Inovadoras Abordagens gerais Transdiferenciação Transdiferenciação Células Tronco Tecido-específicas Reprogramação Nuclear (iPS) Manipulação Imunológica seguida de transplante de HSC Deficiências Enzimáticas: Terapia Substitutiva Manipulação Celular para Induzir ou Inibir a Expressão de Gene(s) Específico(s) Células Tronco Mesenquimais Aplicações Específicas ou Focalizadas

78 Terapias Inovadoras: os Gargalos
Pro Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo Terapias Inovadoras: os Gargalos Células Tronco Tecido Específicas Isolamento em números significativos Obter a célula ou a combinação “correta” iPS Eficiência de indução Indução mais “fisiológica” Obter a diferenciação “correta” Excluir células pluripotenciais

79