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Marina Macagnan Martha Arnold Paula Golin Rafael Soares Roberta Rohde Saulo Mabilde.

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1 Marina Macagnan Martha Arnold Paula Golin Rafael Soares Roberta Rohde Saulo Mabilde

2 Era uma vez...

3 No seu consultório... Uma criança de 1 ano de idade é trazida devido a retardo no crescimento A mãe reclama que a pele de seu filho parece amarelada Ela e seu marido são primos oriundos da Sardenha no Mediterrâneo Ela refere que vários familiares em seu país de origem têm sangue fino e que as vezes precisam de injeções especiais

4 Você notou que a criança: estava abaixo do desenvolvimento esperado estava ictérica apresentava deformidade no crânio seu maxilar era bem pronunciado tinha esplenomegalia

5 Os exames mostraram que: A criança tem anemia hemolítica severa com níveis reduzidos de hemoglobina no sangue ELETROfORESE DA HEMOGLOBINA O sangue contém níveis aumentados de hemoglobina fetal- Hb F Eritrócitos são deformados, pequenos, e mostram anormalidades estruturais.

6 O Rx de crânio mostrou o padrão cabelo- em-escovinha associado com aumento do espaço medular

7 ?

8 -talassemia

9 Etiologia Histórico: - Von Jakhs - Thomas Cooley - Origem do Nome Definição de talassemia Definição de β-talassemia Características Iniciais

10 Distribuição geográfica : - origem - mutações talassêmicas - movimentos migratórios Mutações com efeitos semelhantes: Países mediterrâneos África tropical Sudeste da Ásia Índia Sul da China Epidemiologia

11 Grandes Correntes Migratórias: - tráfico negreiro - migração italiana - migração de caribenhos e africanos - indianos, cipriotas e paquistaneses - asiáticos Diagnóstico Intra-uterino Dados da O.M.S.: α-talassemia β-talassemia Epidemiologia

12 Β-talassemia pelo mundo: - Itália : 2 a 15 % - Grécia : 8 % - Chipre : 18 % - Península Ibérica : 0,1 a 2 % - Sul da Europa : mais de 4 milhões de heterozigotos. - Am. Latina e Caribe : 1 a 2 % de heterozigotos. Epidemiologia

13 Três tipos diferentes de apresentação fenotípica TALASSEMIA MAIOR - anemia de Cooley - reduzida síntese de HbA - dados clínicos: 1°. ano de vida (características peculiares) anemia intensa (hemoglobina<6,5 g/dl) esplenomegalia volumosa redução da massa muscular alterações craniofaciais atraso no crescimento Apresentação Clínica

14 obs.: transfusões crônicas de sangue crianças tratadas inadequadamente ou tardiamente não tratado Apresentação Clínica

15 TALASSEMIA INTERMEDIÁRIA β-talassemia heterozigótica mutações e combinações complexas manifestações clínicas: - anemia leve á moderada(hemoglobina entre 7 e 11 g/dl) - esplenomegalia - redução da massa muscular - alterações faciais - úlceras crônicas na perna - sintomas compressivos Apresentação Clínica

16 TALASSEMIA MENOR β-talassemia heterozigótica Uma única mutação β-talassêmica Dados clínicos: - anemia moderada a mínima - microcitose profunda - normalmente assintomáticos Obs.: diminuição dos níveis de hemoglobina diagnóstico difícil de ser estabelecido Apresentação Clínica

17 Fisiologia

18 Síntese da Hemoglobina Duas cadeias de globina ( e não ) Com exceção das primeiras semanas de embriogênese, uma cadeia é sempre. Feto: cadeia não chamada Depois do nascimento: cadeia β se pareia com a globina. Hemoglobina completa: 2 cadeias α e+ 2 cadeias não.

19 Hemoglobina A

20 Síntese da Hemoglobina Genes que codificam a cadeia da α globina estão no cromossomo 16. Genes que codificam a produção de cadeias não estão no cromossomo 11.

21 A Hemoglobina e seus genes

22 Ontogenia da Síntese da Hemoglobina No cromossomo 11 os genes das globinas são ativados em seqüência durante o desenvolvimento, da extremidade 5´para 3´. ε embriogênese desenvolvimento fetal perto do nascimento

23 Ontogenia da Síntese da Hemoglobina

24 Hemoglobinas no Adulto 2 cadeias α + 2 cadeias β Hb A (97%) 2 cadeias α + 2 cadeias Hb A2 (2%) 2 cadeias α + 2 cadeias Hb F (1%)

25 Fisiopatologia

26 Produção de β globina: anemia microcítica hipocrômica globina : importância só no período pós- natal beta talassemia evidente meses após nascimento

27 Fisiopatologia Cadeias em excesso insolúveis precipitação lesão membrana perda potássio síntese de DNA prejudicada destruição de precursores eritrocitários na MO (eritropoiese ineficaz) 70 a 85 % dos normoblastos podem ser destruídos Gene intacto níveis elevados

28 Fisiopatologia Nível de Hb F aumentado devido à sobrevida seletiva e por produção aumentada da população de hemácias adultas que contém Hb F.

29 Alterações Morfológicas Expansão da MO adelgaçamento do osso cortical neoformação óssea na face externa do osso (maxilar, ossos frontais da face e crânio) Hepatoesplenomegalia devido à hiperplasia do SRE e à hematopoiese extramedular. Hemossiderose, Hemocromatose secundária (transfusões, absorção intestinal de ferro)

30 Alterações Morfológicas

31 Mecanismos da Anemia Eritropoiese pode aumentar + de 10 vezes, 95% pode ser ineficaz. Efeitos deletérios do excesso relativo de cadeias de globina. O excesso interfere na maturação eritropoiética normal: morte intramedular de precursores das células vermelhas por parada na fase G1; apoptose intramedular acelerada dos eritroblastos tardios

32 Mecanismos da Anemia Acúmulo de cadeias na membrana das células vermelhas: anormalidades bioquímicas danosas ao citoesqueleto Presença de ferro na membrana pode agravar efeitos deletérios.

33 Conseqüências clínicas da Anemia Expansão da medula vermelha : 30X > que o normal volume plasmático (shunting através da medula expandida) e a progressiva esplenomegalia exacerbam a anemia. eritropoetina formação tecido extramedular massas extra-ósseas no abdome tórax e pelve

34 Conseqüências clínicas da Anemia Expansão MO deformidades do crânio e face, osteopenia e defeitos na mineralização óssea podem agravar uma síndrome periarticular dolorosa microfraturas e osteomalácia.

35

36 Genética Molecular da -talassemia

37 SEQ.CAP PROMOTOR EXON1 EXON2 SEQ 5´UTR INTRON1 INTRON2 EXON3 CODON TERM. 3´UTR Presente no cluster do gene HBB, juntamente com os genes da γ- globina, ε-globina e δ-globina. Gene da β-Globina Humana (HBB) Locus 11p15.5 Produto cadeia de β- globina humana

38 PROMOTOR 5 Regiões de regulação tecido-específicas: CACCC proximal (motif) CACCC distal CAAT TATA GATA I

39 SEQ.CAP PROMOTOR ACATTTG Início da transcrição Recebe um cap nucleotídeos necessário para o RNAm ligar-se ao ribossomo para subseqüente tradução.

40 SEQ.CAP PROMOTOR SEQ 5´UTR Seqüência transcrita e posteriormente não traduzida Importante para a estabilidade do RNA

41 SEQ.CAP PROMOTOR EXON1 SEQ 5´UTR 90 pares de bases aminoácidos 1-30

42 SEQ.CAP PROMOTOR EXON1 SEQ 5´UTR INTRON1 130 pares de bases importante no processamento do RNAm nuclear e saída do núcleo

43 SEQ.CAP PROMOTOR EXON1 EXON2 SEQ 5´UTR INTRON1 130 pares de bases aminoácidos

44 SEQ.CAP PROMOTOR EXON1 EXON2 SEQ 5´UTR INTRON1 INTRON2 850 pares de base

45 SEQ.CAP PROMOTOR EXON1 EXON2 SEQ 5´UTR INTRON1 INTRON2 EXON3 126 pares de bases aminoácidos

46 SEQ.CAP PROMOTOR EXON1 EXON2 SEQ 5´UTR INTRON1 INTRON2 EXON3 CÓDON TERM. Códon de terminação

47 SEQ.CAP PROMOTOR EXON1 EXON2 SEQ 5´UTR INTRON1 INTRON2 EXON3 CODON TERM. 3´UTR Transcrito e não traduzido Sítio de ligação da Poli(A) do RNAm

48 CAP EXON1EXON2 INTRON1INTRON2 EXON3 POLI(A) RNAm nuclear Adição de um CAP de guanosina-metilada na extremidade 5´ Adição da cauda POLI(A), na extremidade 3´ RNAm maduro Processamento dos introns (splice) CAP EXON1EXON2EXON3 POLI(A)

49 Sumário dos passos envolvendo a produção da β-globina e da hemoglobina

50 Base Molecular da ß-Talassemia São classificadas em,,,,, e dependendo da cadeia ou cadeias cuja síntese é defeituosa As -talassemias podem ser divididas de acordo com a ausência completa ou apenas deficiência na síntese de cadeia de -globina humana em: - 0 -talassemia - + -talassemia

51 Bases moleculares das β-talassemias simples A maior parte das mutações causam diminuição na produção de mRNA ou formação de mRNA não funcionais Um pequeno grupo de mutações, nonsense ou frameshift, ocorrem na região codificante do gene (exons) Grandes deleções no cluster do gene HBB podem resultar em talassemias complexas

52 Classificação das mutações beta-talassêmicas Mutações que podem causar: Defeito na síntese de mRNA: splice junctions; introns; exons; Formação de mRNA não funcionais; Alteração na adição da cauda poli- A ou no caping; Mudança em áreas regulatórias.

53 Mutações nas splice junctions Podem causar alteração nas regiões doadora 5ou aceptora 3 dos introns ou em seqüências consensuais que rodeiam as junções; Ocorre a formação de locais de splice crípticos, que nada mais são do que áreas alternativas de splice, que competem com áreas normais; Fenótipo é de β + -talassemia. Intron Exon

54 Mutações em Introns Qualquer mutação que torne uma região críptica de splice mais parecida ou até mesmo idêntica à região de splice normal Ocorre então competição entre a região críptica ativada e a região de splice normal Fenótipo de β + -talassemia Intron Exon

55 Mutações em Exons afetando o Splicing Causam alteração na região codificante do gene HBB Podem resultar em mudança tanto na seqüência de aminoácidos da cadeia de β-globina quanto na quantidade de formação de RNAm específicos Fenótipo de variante estrutural. Exemplo HB E Intron Exon

56 Splicing

57 Mutações que causam formação de RNAm não funcional Exemplo são mutações que formam um código de parada prematuro Podem ser causadas por substituição de um único aminoácido ou por frameshift Exon

58 Mutações que causam alteração na cauda Poly(A) ou no capping do RNAm Impedem as modificações pós- transcricionais do mRNA, ou pelo capping não correto na extremidade 5 ou por não poliadenização da extremidade 3 Afetam a estabilidade do mRNA formado Fenótipo geralmente de β + -talassemia

59 Mutações que Afetam a Área do Promotor Geralmente deleções ou mutagênese pontual O fenótipo depende dos boxes (seqüências consensuais) onde ocorreu a mutação No CACCC principal proximal fenótipo mais severo, enquanto no CACCC distal o fenótipo pode ser silencioso

60

61 –Mutação Fenótipo Origem Étnica Promoter Mutantes -101 (C to T) B(+)Turquia -88 (C to A) B(+)Mediterrnea -87 (C to G) B(+) Negro Americana Mutantes que causam códon de parada Códon 1 (-1 bp) B(0) Chinesa Códon 6 (-1 bp) B(0) Mediterrânea Códon 114 (-2, +1 bp) B(+) Francesa Mutações na Splice Junction IVS-1, position 1 (G to A) B(0) Mediterrânea IVS-1, position 2 (T to G) B(0) Indiana, Chinesa Novo Local de Splice IVS (G to A) B(+)Mediterrânea Defeito no Cleavage do RNA AATAAA to AACAAAB(+) Negro Americana

62 Fatores Genéticos que Afetam a Severidade Clínica: Natureza das mutações no gene HBB; Co-herança de -talassemia; Quantidade de hemoglobina fetal produzida.

63 LCR – Locus Control Region Super-enhancer Estabelecem a abertura da cromatina, inibindo a repressão normal da transcrição Localizado aproximadamente 20 Kb anteriormente ao cluster Contém cinco locais que são hipersensíveis à DNase, apenas nas células eritróides precursoras

64 A presença do LCR inteiro é fundamental para a transcrição dos genes presentes no cluster do HBB Pacientes com deleções nos LCR falham em expressar todos os genes do cluster do HBB Essencial para terapia gênica LCR – Locus Control Region

65 Padrão de Herança Autossômico recessivo; Recentemente foi relatado em algumas famílias padrão de herança autossômico dominante.

66 Fenótipos Talassemia Menor Talassemia Maior Normal

67 Se ambos os pais não forem portadores então todos os seus filhos serão normais. Padrão de herança recessivo

68 Se apenas um dos pais é portador e o outro normal, os filhos terão 50% de chance de ter Talassemia menor, porém nenhum deles terá Talassemia maior.

69 Padrão de herança recessivo Se ambos os pais forem portadores, seus filhos terão 25% de chance de herdarem talassemia maior; 50% talassemia minor e 25% de chance de nascerem normais.

70 Padrão de herança autossômica dominante Resultam de uma família de mutações, geralmente envolvendo o exon 3 do gene HBB Ocorre produção de cadeias de globina hiper-instáveis, com tamanhos variados, que se precipitam junto com as cadeias em em excesso de -globina nas células precursoras hemáticas

71 Diagnóstico

72 Diagnóstico Clínico Diagnóstico Clínico-laboratorial Eletroforese Cromatografia Análise Molecular Diagnóstico Diferencial

73 Diagnóstico Clínico História médica individual - idade de início clínico História médica familiar Origem étnica Exame físico - crescimento e desenvolvimento - palidez e icterícia - tamanho hepático e esplênico - estrutura óssea

74 Diagnóstico Clínico- laboratorial Hemograma completo -VCM -HCM / CHCM -RBC -RDW Esfregaço de sangue periférico

75 -VCM- Elemento <72 fL diagnóstico presuntivo Diagnóstico Clínico- laboratorial

76 -HCM/CHCM- Talassemia menor : g/dL Talassemia maior : <7 g/dL Diagnóstico Clínico- laboratorial

77 -RBC- Na anemia microcítica Talassemia RBC X Ferropenia RBC Diagnóstico Clínico- laboratorial

78 -RDW- Talassemia : RDW X Ferropenia : RDW Diagnóstico Clínico- laboratorial

79 Esfregaço de sangue periférico - microcitose - hipocromia - anisocitose - poiquilocitose - eritroblastos - inclusões de cadeias α Diagnóstico Clínico- laboratorial

80 Esfregaço

81

82 Objetivo: qualificar e quantificar a Hb - Hb A - Hb F - Hb A 2 Eletroforese

83 Normal + o Hb A (%) Hb F (%) Hb A 2 (%) Eletroforese

84 Cellulose Acetate Electrophoresis Pouca distinção entre Hb A e Hb F

85 Citrate Agar Electrophoresis Teste confirmatório e pós-natal

86 Thin Layer Isoelectric Focusing Gradiente de pH e boa resolução

87 Cromatografia Objetivo: maior precisão HPLC - High Performance Liquid Cromatography Screening Custo elevado

88 HPLC-cromatografia

89

90 Análise molecular Objetivo: identificar mutações específicas Diferencia alelos Embasar aconselhamento genético Pós-diagnóstico clínico-laboratorial/pré- natal

91 PCR Seqüenciamento (eletroforese) Análise molecular

92 Diagnóstico Diferencial Talassemia Anemia Ferropriva HEMOGRAMA X

93 Mentzer index: VCM/RBC <13 talassemia >13 ferropenia Eletroforese perde valor Diagnóstico Diferencial

94 Tratamento

95 Primeiro passo é distinguir entre: Talassemia Maior Talassemia Menor Talassemia Intermediária Tratamento da -talassemia

96 Transfusão Sangüínea Terapêutica Quelante Transplante de Medula Óssea Esplenectomia Apoio Psicológico Tratamento da -talassemia Maior

97 Transfusão Sangüínea Objetivo: HB > 10gdL Quando: precocemente Efeitos Favoráveis: crescimento, atividade física, hiperplasia medula óssea, deformidades ósseas, esplenomegalia Precauções: vacinação contra a Hepatite B, controle do sangue transfundido Tratamento da -talassemia Maior

98 Terapêutica Quelante Objetivo: evitar hemossiderose Quando: após 1 ano do início das transfusões / após transfusões Como: infusão subcutânea lenta Efeitos Favoráveis: evitar lesões orgânicas graves como insuficiência de glândulas endócrinas, fígado e miocárdio provocadas pelo acúmulo de ferro Efeitos Colaterais: raros Uso da vitamina C associada Tratamento da -talassemia Maior

99 Transplante de Medula Óssea Objetivo: cura Quando: antes que apareçam as complicações Como: irmão(ã) HLA idêntico Sucesso: 80% Riscos Tratamento da -talassemia Maior

100 Esplenectomia Objetivo: medida auxiliar Quando: benefícios maiores que a manutenção do baço Precauções: vacina anti-pneumococo Antibioticoterapia profilática Febre Tratamento da -talassemia Maior

101 Acompanhamento do Tratamento exame físico mensal ALT bimensal ferritina sérica a cada 3 meses crescimento e desenvolvimento audiometria e ofltalmo anualmente avaliação cardíaca completa, US fígado, tireóide, pâncreas, adrenal, paratireóide e hipófise Tratamento da -talassemia Maior

102 Apoio Psicológico Esclarecer a natureza da doença, sua evolução, tratamento e complicações Reforçar a terapia quelante Adolescência Prognóstico Transfusões regulares Ferritina sérica abaixo de 2500 ng/mL Tratamento da -talassemia Maior

103 Tratamento Sintomático Esplenectomia Suplementação ácido fólico Radioterapia de massas extramedulares Transfusões – quelantes Úlceras maleolares Tratamento da -talassemia Intermediária

104 Geralmente assintomático Confusão Gravidez Tratamento da -talassemia Menor

105 Três estratégias: Transferência de Genes Correção da seqüência DNA/RNA mutante Diminuição da expressão do gene da -globina Tratamento Experimental da -talassemia

106 Diagnóstico Pré-natal

107 Objetivos Sistematizar o tratamento Melhorar prognóstico

108 Exames-padrão PCR e seqüenciamento de DNA: amniocentese Eletroforese ou HPLC: cordocentese ou coleta de sangue fetal

109 Método População de Risco Exames Aconselhamento Genético

110 Desvantagens Impossibilidade de coleta Aborto espontâneo em 1-2% dos casos

111 Balanço Apesar de haver riscos, há grandes vantagens em fazer-se uso do diagnóstico pré-natal

112 Rastreamento

113 Definição Método pelo qual se busca, numa população de risco, indivíduos portadores de uma doença

114 Eficácia -talassemia: informação e métodos rápidos e acessíveis para realizar o rastreamento

115 Diagnóstico Neo-natal Teste do pezinho

116 Método Métodos hematológicos e análise de DNA

117 Resultados Aparentemente o status de portador não causa ansiedade Redução do nascimento de crianças beta-talassêmicas no Mediterrâneo

118 Aconselhamento Genético

119 Definição O aconselhamento genético é o processo de providência individual e familiar de informações sobre a natureza, hereditariedade e implicações de doenças genéticas para ajudá-los a tomar decisões informadas de caráter médico e pessoal

120 Objetivo Esclarecer: - Evolução da doença - Riscos para futuros filhos Obs.: Não é objetivo do aconselhamento genético a erradicação da doença

121 Influências Inúmeras Modulam o caráter do serviço Podem, mas não devem, mudar o desfecho

122 Enfoques Depende de: População Família Pessoa Exemplos

123 Princípio A decisão final sempre é do paciente e não deve ser influenciada pelo orientador do serviço

124 Benefício Prevenção de novos casos de - talassemia, pela prevenção de gravidezes de risco

125 Obrigado


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