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Hemoglobinas normais e patológicas BIO10-329 Biofísica de Proteínas Regente: Célia R. Carlini Os assuntos abordados nessa aula são: Relações estrutura.

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1 Hemoglobinas normais e patológicas BIO Biofísica de Proteínas Regente: Célia R. Carlini Os assuntos abordados nessa aula são: Relações estrutura X função: comparação com a mioglobina Aspectos ontogenéticos e filogenéticos Hemoglobinopatias Atenção ! Use o modo apresentação de slides para ativar as animações

2 As globinas constituem um bom exemplo para se compreender as relações entre a estrutura e a função das proteínas. A Hemoglobina é um hetero-tetrâmero formada por 2 tipos de globinas: e. Max Perutz e John Kendrew resolveram a estrutura 3D da hemoglobina em 1959

3 O ambiente hidrofóbico em torno do heme é fundamental para a atividade biológica das globinas, que depende de uma interação reversível com oxigênio. Fe ++ Fe ++.O 2 A mioglobina da baleia cachalote é uma proteína monomérica de 153 aminoácidos composta por 7 segmentos de -hélice, denominados de A a H. As porções da cadeia polipeptídica entre segmentos de -hélice são chamados cotovelos. As globinas apresentam um bolsão (fenda) hidrofóbico no qual se aloja o grupo prostético heme. Estrutura 3D do esqueleto covalente da mioglobina.

4 Comparação das seqüências de aminoácidos da mioglobina (Mb, 153 aa) e das globinas (Hb, 141 aa) e (Hb, 146 aa) da hemoglobina de cavalo. As seqüências começam com o resíduo N-terminal NA1 (à esquerda, em cima), antes da hélice A, composta por 16 aminoácidos. Segue a hélice B, também com 16 resíduos, e assim até a hélice H. Os aminoácidos idênticos nas três proteínas estão marcados em cinza, e os que interagem com o heme aparecem em rosa. Entre esses últimos estão a His E57 e a His F8 que ocupam a mesma posição espacial nas 3 moléculas, apesar de terem posições diferentes nas seqüências correspondentes. Observe que o grau de identidade da seqüência entre as três globinas é relativamente baixo, da ordem de 20% (27 resíduos).

5 mioglobina globina hemoglobina Comparação das estruturas 3D das globinas e da hemoglobina e mioglobina Observe a semelhança estrutural das 3 globinas, formadas por 7 segmentos de -hélice que delimitam uma fenda, na qual se localiza o heme.

6 Considerando: 1)que a seqüencia de aminoácidos é o que determina a estrutura 3D de uma proteína, 2)e o baixo grau de identidade das 3 sequëncias globínicas, Como se explica o fato delas possuírem estrutura 3D tão semelhantes ? Como visto na aula anterior, os radicais dos aminoácidos não participam das ligações que estabilizam a -hélice. Assim, pode haver mudanças na seqüência primária de uma proteína sem afetar a estrutura secundária, no caso dessas ocorrerem numa região de -hélice ou de folha. Como as globinas contêm grande proporção de -hélices, ao longo da evolução acumularam número significativo de mutações pontuais sem alteração de sua forma 3D..

7 Outros derivados porfirínicos não hemínicos importantes são a cobalamina ou vitamina B12, que contem Co 2+ ao invés de ferro, e clorofilas, que contém Mg 2+ O heme das globinas é responsável pela ligação ao oxigênio. O heme, também presente nos citocromos, é sintetizado nas células aeróbicas através de uma cadeia complexa de enzimas, a via das porfirinas. Na última etapa, um átomo de ferro é introduzido na protoporfirina IX, originando o heme. Heme sintase + Fe 2+

8 Nas globinas, o Fe 2+ hemínico faz 6 ligações de coordenação: 4 ligações planares com os nitrogênios dos anéis pirrólicos da protoporfirina, e 2 perpendiculares ao plano do heme. A 5ª. ligação é permanentemente ocupada com um dos N imidazólico da histidina F8 (proximal). A sexta coordenação pode ser ocupada pelo oxigênio, ou pela histidina E7 (distal) nas globinas desoxigenadas. No desenho ao lado, a globina. Observar os resíduos hidrofóbicos (em preto) que forram o bolsão do heme nas globinas. Fe

9 A Hemoglobina, composta por quatro cadeias polipeptídicas (dois dímeros ), é uma proteína transportadora de oxigênio. apresenta afinidade variável por O 2 A estrutura tetramérica da hemoglobina confere à molécula maior controle da afinidade por oxigênio 1 heme = 1 O 2 A Mioglobina, composta por uma cadeia polipeptídica, é uma proteína armazenadora de oxigênio presente no tecido muscular de mamíferos. apresenta alta afinidade por O 2

10 A Mioglobina (Mb) tem a curva hiperbólica, e atinge 50% de saturação (p50) com uma pO 2 de ~1 torr. A Hemoglobina (Hb) tem a curva sigmóide, indicando alosteria ou cooperativadade entre suas subunidades. Sua pO 2 é de ~ 26 torr e sua afinidade pelo O 2 varia com o grau de saturação da molécula. A curva de saturação com O 2 mostra diferenças importantes na afinidade da hemoglobina e da mioglobina pelo oxigênio. A curva de saturação descreve a percentagem de moléculas carregando O 2 (eixo y) à medida que se aumenta a pressão parcial do gás (pO 2, eixo x). Observe os valores da pO 2 venosa (nos tecidos) e arterial (nos pulmões). A diferença de afinidade por O 2 faz com que nos tecidos, a Mb fique 100% saturada, enquanto que a saturação da Hb diminui a ~55%, liberando de 1 a 2 moléculas de O 2. Essa diferença de comportamento está de acordo com a função de armazenamento de O 2 da Mb e de transporte de O 2 pela Hb.

11 Por que a afinidade da hemoglobina pelo oxigênio é 26 vezes menor do que a da mioglobina, se as proteínas possuem as estruturas 3D de suas cadeias globínicas (ambiente onde está o complexo heme-Fe 2+ ~ O 2 ) tão semelhantes ? Quais são os mecanismos que fazem a afinidade da hemoglobina variar conforme o grau de saturação em O 2 ? Por que isso não ocorre com a miglobina ?

12 A hemoglobina passa por várias alterações conformacionais na transição do estado desoxigenado para oxigenado. No estado oxigenado, a cavidade central do tetrâmero diminue. Vários loops se movem. O2O2

13 Observar os movimentos da cadeia em relação ao Heme. A histidina 92 é a F8 proximal. Alterações conformacionais da hemoglobina A durante a transição do estado oxigenado para desoxigenado Observar a expansão da cavidade central do tetrâmero e as mudanças nos contactos entre as subunidades

14 O estado de oxigenação afeta propriedades físicas da Hemoglobina como a interação com a luz visível. A hemoglobina desoxigenada interage mais com a luz azul (absorção no comprimento de onda de nm), dando ao sangue venoso uma cor acastanhada (não é sangue sujo !), quando comparado ao sangue arterial. Alterações conformacionais da hemoglobina A durante a transição do estado oxigenado para desoxigenado

15 As alterações conformacionais que ocorrem nas cadeias globínicas da hemoglobina na transição oxigenação-desoxigenação são transmitidas de uma cadeia a outra, através de contactos nas interfaces das subunidades. Esse fenômeno é a base molecular da cooperatividade, uma forma de alosteria característica de proteínas oligoméricas. Por ser monomérica, a mioglobina não tem essa propriedade. A cooperatividade na hemoglobina é positiva. Isso significa que quando uma cadeia passa do estado oxigenado para o desoxigenado, as alterações conformacionais que essa molécula sofre são sentidas pelas cadeias vizinhas. Essas, por sua vez, respondem com uma diminuição de sua afinidade pelo oxigênio, facilitando a desoxigenação da hemoglobina. O mesmo tipo de fenômeno ocorre na oxigenação da molécula, que também acontece de forma positivamente cooperativa. A cooperatividade na transição oxigenação-desoxigenação da hemoglobina é a causa de sua curva de saturação ter aspecto sigmóide, e uma das razões da afinidade variável da hemoglobina pelo oxigênio.

16 O efeito Bohr é a modulação da afinidade da Hb por O 2 pelo pH do meio, facilitando a desoxige- nação da Hb a nível tecidual. O sangue venoso é mais ácido do que o arterial, pela presença de CO 2 vindo dos tecidos. Esse forma ácido carbônico H 2 CO 3, que se dissocia liberando H + para o meio. A curva ao lado mostra como a % de saturação da Hb, em uma pO 2 próxima aos valores nos tecidos (20 torr), diminue em função do pH do meio. Vários mecanismos regulam a afinidade da hemoglobina pelo oxigênio. O efeito Bohr é um dos mais importantes em termos fisiológicos. Para a mesma pO 2, a saturação da Hb diminue de 45% em pH 7,6 para 22% em pH 7,2.

17 HEMÁCIAS PLASMATECIDOS Para entender o efeito Bohr, vamos ver como se dão as trocas de gases na Hb, e suas propriedades de tampão. 1.Nos tecidos, a pO2 é de 25 a 40 torr e o pH ligeiramente mais ácido (7,2-7,3). O CO 2 produzido difunde-se para o plasma e para as hemácias. 2.Nas hemácias, o CO 2 é convertido a H 2 CO 3 pela enzima anidrase carbônica. 3.O H 2 CO 3 se dissocia no íon bicarbonato HCO 3 - e um próton H +. Parte do HCO3 - (~60%) difunde para o plasma, onde constitue o principal sistema tampão. 4.Uma parte pequena (~8%) do CO2 liga-se diretamente ao resíduo N-terminal de cada globina, formando a carbamino-Hb. CO 2 DIFUSÃOCO 2 (1) H 2 CO 3 +H 2 O Anidrase carbônica (2) + Cl O HCO 3 - transportado no plasma representa 60% do CO 2 formado nos tecidos HCO 3 - H+H+ Cl (3) Hb NH 3 + Hb NHCOO - (4) pO2 – 25 a 40 torr

18 HEMÁCIAS PLASMATECIDOS Para entender o efeito Bohr, vamos ver como se dão as trocas de gases na Hb, e suas propriedades de tampão. 5.O próton H + gerado da dissociação do H 2 CO 3 é tamponado por histidinas que ligam o heme. 6.Ao receber o próton, a HbO 2 sofre o efeito Bohr, que resulta em uma diminuição da afinidade pelo o O 2, facilitando a desoxigenação. 7.Concordando com o efeito Bohr, a Hb oxigenada é mais ácida (pK ~7.4) do que a Hb desoxigenada (pK ~7.6 ). H 2 CO 3 +H 2 O Anidrase carbônica CO 2 DIFUSÃOCO 2 + Cl O HCO 3 - transportado no plasma representa 60% do CO 2 formado nos tecidos HCO 3 - Cl H+H+ Hb NH 3 + Fe O2 O2 H H C C N N NH HC C C (5) Fe 2+ H H C C N N NH2NH2 N HC C C Hb NHCOO - (5) (6) O2O2 DIFUSÃO (6) pO2 – 25 a 40 torr

19 HEMÁCIAS PLASMAALVÉOLOS Para entender o efeito Bohr, vamos ver como se dão as trocas de gases na Hb, e suas propriedades de tampão. 8.No pulmão, a pO 2 é de 100 torr e o pH é mais alcalino (pH ~7.6). 9.A Hb desoxigenada recebe O2 e libera os prótons H+ recebidos no tecido. O efeito Bohr agora resulta em um aumento da afinidade pelo o O 2, facilitando a oxigenação. 10.Esses fatores fazem a anidrase carbônica catalizar a reação reversa, formando CO 2 e H 2 O a partir de H 2 CO 3, resultante da associação bicarbonato e H +. Hb NHCOO - Fe 2+ H H C C N N NH NH2 HC C C FeO2 H H C C N N N NH HC C C Hb NH 3 + O2O2 DIFUSÃO (9) pO2 – 100 torr (11) 11. O CO 2 ligado à Hb é liberado. 12. O CO 2 difunde para o plasma e daí para os alvéolos. H+H+ + H 2 O Anidrase carbônica CO 2 (10) O HCO 3 - transportado no plasma representa 60% do CO 2 formado nos tecidos + Cl HCO 3 - H 2 CO 3 Cl (10) DIFUSÃOCO 2 (12)

20 O 2,3-bifosfoglicerato (2,3 BPG) é um produto exclusivo do metabolismo das hemácias, formado a partir de um dos intermediário da via glicolítica, por uma enzima mutase específica. Glicose 1,3 bifosfoglicerato piruvato 2,3-BPG Mutase (só em hemácias) Via glicolítica nas hemácias Vários mecanismos regulam a afinidade da hemoglobina pelo oxigênio. O 2,3-difosfoglicerato é um regulador alostérico negativo da hemoglobina. A ligação de uma molécula de 2,3 BPG à hemoglobina reduz a sua afinidade por O 2, facilitando a desoxigenação. O 2,3 BPG liga-se na cavidade central do tetrâmero da hemoglobina, estabilizado por interações eletrostáticas com resíduos de carga positiva.

21 Na oxihemoglobina, a cavidade central é menor, expulsando o 2,3-DPG e aumentando a afinidade da molécula por O2. A mudança conformacional que ocorre na primeira desoxigenação torna essa cavidade maior na desoxi-hemoglobina, possibilitando a ligação do 2,3-DPG. A concentração plasmática de 2,3-DPG é constante, ~5 mM. Populações que habitam regiões de elevada altitude, onde a atmosfera é rarefeita, apresentam como mecanismo compensatório um aumento nos níveis da enzima mutase que forma o 2,3 BPG. Com concentrações plasmáticas mais elevadas de 2,3-BPG, e uma consequente diminuição da afinidade da Hb por O 2, não há prejuizo da oxigenação dos tecidos, apesar da pO2 atmosférica mais baixa eventualmente não ser suficiente para saturar 100% a Hb.

22 A regulação da afinidade da hemoglobina pelo O 2 é um somatório do efeito Bohr e do 2,3 –bifosfoglicerato, além da cooperatividade positiva. Stripped Hb – Hb sem nenhum modulador Whole blood – Hb em sangue total, com todos seus moduladores A figura ilustra a somatória de efeitos moduladores negativos do 2,3 BPG e do CO 2 (efeito Bohr) sobre a afinidade da hemoglobina para o oxigênio. Observe como a P50 (pressão parcial de O 2 que satura 50% das moléculas) aumenta progressivamente a medida que os moduladores são adicionados ao meio. O efeito Bohr (presença de CO 2 ) e o 2,3-BPG, juntos, diminuem em cerca de 2,6 vezes a afinidade da Hb pelo O 2. 50%

23 Evolução das globinas heme mioglobina hemoglobina Na evolução das globinas, houve um evento de duplicação gênica, e depois, divergência de cada um dos genes através de mutações pontuais, que acabaram originando as duas cadeias globínicas da atual hemoglobina.

24 Ontogenia das hemoglobinas humanas A hemoglobina A (HbA), composta das cadeias e, corresponde a % da hemoglobina total de um adulto. Um variante normal da hemoglobina A, correspondente a 2-3% da hemoglobina total em adultos, é a HbA2, formada por cadeias e (delta), ou seja,. No adulto, a Hemoglobina A resulta da expressão co-dominante de 2 genes que codificam a cadeia e de 4 genes que codificam a cadeia. Durante a vida embrionária e fetal, diferentes genes para as globinas são expressos sucessivamente. Existem 17 genes para globinas no genoma humano.

25 Hb embrionárias Hb Gower 1 Hb Gower 2 Hb Portland Hb Fetal Hb adulto Ontogenia das hemoglobinas humanas: 17 genes codificando cadeias globínicas idade gestacional idade pós-natal (semanas) (semanas) nascimento O gráfico e a tabela mostram a sucessão de diferentes hemoglobinas e a sua composição em cadeias globínicas presentes no embrião, feto (após a 12a. semana) e no adulto. Após o nascimento, com a repressão da síntese da cadeia e aumento da síntese da cadeia, ocorre a troca da HbF pela HbA, que se completa entre o 3o e 4o mês de vida. Nessa fase são muito importantes os banhos de luz dados na criança, pois estes auxiliam na degradação de derivados tóxicos do heme, formados na destruição das hemácias fetais.

26 A Hemoglobina Fetal (HbF) A HbF possue cadeias (gama) equivalentes à cadeia da bA, com 10 aminoácidos diferentes nas sequências primárias dessas globinas. Uma das substituições importantes na HbF é a posição 82 da cadeia, que possui um resíduo de serina (polar sem carga), diferentemente da cadeia que tem lisina (Lys82; com carga positiva) nessa posição. Essa substituíção resulta numa ligação mais fraca do 2,3-DPG, que interage com as globinas por interações eletrostáticas, à HbF. Como resultado, a HbF apresenta maior afinidade por O 2 do que a HbA materna, possibilitando a captação de O 2 a nível da barreira placentária. Ligação do 2,3-BPG com a hemoglobina A

27 Hemoglobinopatias Como existem 4 alelos de cadeia e 2 de cadeia e xpressos co-dominantemente, são conhecidos mais mutantes de cadeia (produzem 50 % de Hb anômala) do que de cadeia (produção de 25 % d e Hb anômala). Hemoglobinopatias podem resultar de mutações nos genes estruturais das globinas, ou ainda nos genes reguladores da síntese das diferentes globinas, que é o caso das talassemias. Mutações pontuais nos genes das globinas e são relativamente frequentes. Em outubro de 2003 já eram conhecidos mais de 900 tipos de hemoglobinas anômalas contendo a troca de 1 aminoácido na cadeia a ou na cadeia b. Mutações duplas, inserções e deleções são casos mais raros. A figura acima ilustra posições na sequência primária de cadeias ou para as quais são conhecidos mutantes pontuais de Hb com alterações na estabilidade e/ou solubilidade da proteína ou na afinidade por oxigênio, que resultam em patologias. Observe que a grande maioria dessas posições estão em cotovelos da molécula, onde as -hélices não existem. Mutantes das histidinas proximal e distal (posições 92 e 63 na cadeia, respectivamente), podem resultar em incapacidade de ligar O

28 A tabela mostra exemplos de hemoglobinas anormais que são mutantes pontuais. Hemoglobina* Anormal Resíduo Normal e Posição Substituição Cadeia Alfa(4 alelos) TorinoFenilanina43 Valina M Boston Histidina 58Tirosina ChesapeakeArginina92Leucina G Georgia Prolina9 Leucina TarrantAspartato126Asparagina SuresnesArginina141 Histidina Cadeia Beta(2 alelos) SGlutamato6Valina Riverdale-BronxGlicina24Arginina GenovaLeucinaProlina ZurichHistidina 63Arginina M Milwaukee Valina 67Glutamato M HydePark Histidina 92Tirosina YoshizukaAsparagina108Aspartato Hiroshima Histidina 146Aspartato * Variantes da hemoglobina normalmente recebem o nome do local geográfico de origem Hemoglobinas M apresentam substituições nas histidinas proximal ou distal, ou resíduos hidrofóbicos do bolsão do heme. Como resultado, nas HbM ocorre a oxidação do Fe 2+ a Fe 3+, tornando-as incapaz de ligar O 2. Metahemoglobina é uma HbA normal oxidada a Fe 3+, situação que pode ser causada por fumaça de cigarro, cianetos, etc. Não confundir metahemoglobina com HbM. Hemoglobina S ou falciforme apresenta uma troca de uma resíduo ácido por um apolar, causando alterações na solubilidade da proteína, que passa a ter tendência de polimerizar. Não há alterações na afinidade pelo O 2.

29 Algumas variantes de hemoglobina com importância clínica Hemoglobina Origem geográfica Substituição de Aminoácido % presente em heterozigotos * Existem outros variantes de HbG de cadeia. A HbG Philadelphia é um variante de cadeia que frequentemente traz deleção dos alelos não afetados. Quando não ocorre deleção, existe ~20% de HbG, com deleção de 1 alelo, ~30% de HbG, e com deleção de 2 alelos, ~40% HbG. *** HbD Punjab apresenta o mesmo tipo de mutação. # Não é uma mutação pontual e sim um porduto de crossover durante a meiose.

30 Anemia falciforme e hemoglobina S (HbS) A HbS apresenta um resíduo de valina na posição 6 da cadeia b, no lugar do ácido glutâmico presente na HbA. Essa troca resulta em alteração da solubilidade da HbS, que apresenta tendência de polimerizar quando desoxigenada, formando fibras que se depositam dentro da hemácia, deformando-a. Deformadas, essas hemácias são retiradas de circulação, causando o quadro anêmico. A figura ao lado é uma micrografia de uma fibras de HbS, que se organizam por polimerização de muitas moléculas, conforme o esquema abaixo. Fibra de HbS Hemácia falcêmica

31 Hemoglobina S: a valina na posição 6 da cadeia da HbS faz interação hidrofóbica com resíduos Phe 85 e Leu 88 da cadeia de outra molécula de HbS, determinando polimerização da HbS desoxigenada. A polimerização reverte quando a HbS fica 100% saturada. Não há alteração da afinidade por O2, ou seja, o efeito Bohr, a ligação do 2,3-BPG e a cooperatividade não são afetados. 6

32 Origem geográfica: região de São Leopoldo, RS, Brasil mutação pontual com substituição de Ser por Cys na posicão 9 da cadeia na região helicoidal A6 por conter uma cisteína a mais, a HbPorto Alegre apresenta tendência de polimerizar, fazendo tetrâmeros via pontes –S-S- a polimerização é baixa in vivo, mas intensa em hemácias armazenadas (diminuição do poder redutor) veja artigo e texto complementar para mais informações. A Hemoglobina Porto Alegre Tetrâmero de HbPA Microscopia eletrônica de tetrâmeros de HbPa


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