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Fisiologia microbiana: nutrição e crescimento Nutrição microbiana –Componentes necessários às células –Meios de cultura –Condições ambientais Crescimento.

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1 Fisiologia microbiana: nutrição e crescimento Nutrição microbiana –Componentes necessários às células –Meios de cultura –Condições ambientais Crescimento populacional –Velocidade de crescimento –Tempo de geração –Medidas do crescimento

2 Introdução De todos os organismos vivos, os microrganismos são os mais versáteis e diversificados em suas exigências nutricionais. Alguns são tão exigentes quanto o homem e outros animais. Todos os organismos vivos compartilham algumas necessidades nutricionais em comum: - carbono - nitrogênio - água NUTRIÇÃO MICROBIANA

3 Em algumas situações os microrganismos são estudados em seu hábitat natural. Ex.: Fendas termais, sistemas de tratamento de resíduos, solo. Para caracterizar suas propriedades ( morfológicas, fisiológicas e bioquímicas ) é necessário o cultivo em laboratório. Cultivo in vitro: quando se conhece as exigências nutricionais Cultivo in vivo: quando exigências nutricionais específicas são desconhecidas. NUTRIÇÃO MICROBIANA

4 Para o cultivo laboratorial (in vitro) são utilizados meios de cultura que simulam e até melhoram as condições naturais. Os elementos químicos principais para o crescimento das células incluem C, N, H, O, S e P e são denominados de macronutrientes. O carbono é um dos elementos mais importantes para o crescimento microbiano (todos requerem carbono) Os compostos orgânicos são os que contém carbono (Exceção para CO 2 )

5 NUTRIÇÃO MICROBIANA MACRO nutrientes : - Necessários em grande quantidade. - Tem papel importante na estrutura e metabolismo. MICRO nutrientes : - Necessários em quantidades mínimas. - Funções enzimáticas e estruturais das biomoléculas Uma célula típica

6 Componentes necessários às células Fonte de Carbono Compostos orgânicos (microrganismos heterotróficos): - Carboidratos - Lipídeos - Proteínas Deles se obtém energia e unidades básicas para o crescimento celular. Utilização de CO 2 (microrganismos autotróficos) É a forma mais oxidada do carbono, assim a fonte de energia provém da luz.

7 Fonte de Nitrogênio - É elemento mais abundante depois do C, cerca de 12% (constituinte das proteínas, ácidos nucléicos, etc.) Moléculas orgânicas (aminoácidos, proteínas, etc.) Moléculas inorgânicas (NH 3, NO 3 -, N 2 ) Componentes necessários às células

8 Hidrogênio -Principal elemento dos compostos orgânicos e de diversos inorgânicos (água, sais e gases) Função do H: –Manutenção do pH –Formação de ligações de H entre moléculas –Serve como uma fonte de energia nas reações de oxi-redução da respiração Componentes necessários às células Oxigênio - Elemento comum encontrado nas moléculas biológicas (aminoácidos, nucleotídeos, glicerídeos...) - É obtido a partir das proteínas e gorduras. Na forma de oxigênio molecular (O 2 ), é requerido por muitos para os processos de geração de energia.

9 P – Sínese de ácidos nucléicos, ATP; S – Estabilidade de aminoácidos, componente de vitaminas; K – Atividade de enzimas; Mg– Estabilidade dos ribossomos; Ca – Estabilidade da parede celular e termoestabilidade de endósporos; Na – Requerido em maior quantidade por microrganismos marinhos; Fe – Papel-chave na respiração, componente dos citocromos e das proteínas envolvidas no transporte de elétrons. Componentes necessários às células Outros macronutrientes:

10 Metais são em quantidades muito pequenas (traço) necessários na composição de um meio de cultura: Zn, Cu, Mn, Co, Mo e B Exercem função estrutural em várias enzimas - Nem sempre sua adição é necessária - Meios sintéticos com compostos de alto grau de pureza e água ultra pura podem apresentar deficiências desses elementos. Requisitos nutricionais - Micronutrientes

11 Água -Componente absolutamente indispensável (com exceção dos protozoários que englobam partículas sólidas) Laboratório: destilada, filtrada, deionizada Outros aditivos Funções: aumentar a conversão, evitar precipitação de íons, controlar a espuma, provocar inibição, estabilizar o pH. Quelantes: na autoclavagem ocorre a precipitação dos fosfatos metálicos Ex.: EDTA, ácido cítrico, polifosfatos Água e outros aditivos

12 Tampões - Carbonato de cálcio - Fosfatos - Proteínas (peptona) Inibidores Ex: produção de ácido cítrico por Aspergillus niger Utiliza-se Fosfato e pH < 2 para reprimir o ácido oxálico Outros aditivos

13 Indutores - A maioria das enzimas de interesse comercial precisa de indutores. Ex: celulose induz a celulase pectina induz a pectinase amido induz a amilase Antiespumantes - Cultivos com aeração ocorre a produção de espuma Remoção de células, perda do produto, contaminação; Redução do volume do meio Um antiespumante reduz a tensão superficial das bolhas (álcoois, ácidos graxos, silicones, poliglicóis,... ) Outros aditivos

14 MEIOS DE CULTURA Soluções nutrientes para promover o crescimento de microrganismos. Classes Quimicamente definidos (sais, compostos orgânicos purificados, água) Complexos (utilizam hidrolisados – caseína, carne, soja, levedura) Não existe um meio de cultura universal, mas Existem vários tipos meios para diversas finalidades Para obter sucesso no cultivo de microrganismos é necessário o conhecimento de suas exigências nutricionais, para que os nutrientes sejam fornecidos de forma e proporção adequada.

15 MEIOS DE CULTURA

16 Como determinar uma composição inicial para um meio de cultivo: Composição elementar média (% do peso seco) ElementoBactériaFungo Carbono5251 hidrogênio77 Nitrogênio138,5 Fósforo2,50,4-4,5 Enxofre0,60,1-0,5 Potássio2,50,2-2,5 Sódio0,750,02-0,5 Cálcio0,550,1-1,4 Magnésio0,250,1-0,5 Cloro0,5- Ferro0,10,15 Relação C:N média4:16:1 Relação C:N:P:S85:23:4:1 Passo 1: utilizar dados da composição elementar Ex: Para produzir 10 g de células bacterianas são necessários de 1,3 g (13%) de N, ou 7,2 g de (NH 4 ) 2 SO 4 (18% de N) Obs.: Sais com dois componentes [(NH 4 ) 2 SO 4 ] podem introduzir o excesso de um deles. Com relação ao carbono considerar também fração para energia e manutenção (heterotróficos) Fração para biomassa: 1,3 x 4 = 5,2 g de C ou 13 g de glicose (40% de C) Fração para energia e manutenção (45%): Y X/S = 55% 13/0,45 = 28,9 g de glicose Relação C:N = 28,9/7,2 = 4:1.... E assim por diante. Passo 2: otimização MEIOS DE CULTURA

17 Temperatura oxigênio pH Pressão atmosférica, hidrostática e osmótica Radiação eletromagnética Condições ambientais

18 Efeito da temperatura no crescimento microbiano

19 Aeróbio Anaeróbio Facultativo Microaerófilo Anaeróbio aerotolerante Efeito do oxigênio no crescimento microbiano Meio gelatinoso com indicador redox: Rosa quando oxidado Incolor quando reduzido Durante as reações de redução do O 2 são formados vários intermediários tóxicos. Ex: H 2 O 2, OH°, O2 - Os microrganismos aeróbios e facultativos utilizam enzimas como a catalase para destruir as formas tóxicas

20 Sistema para cultivo de anaeróbios Sistema para cultivo de aeróbios a b

21 Em microbiologia crescimento geralmente é o aumento do número de células Na maioria dos procariotos ocorre a fissão binária: crescimento e divisão Varia de minutos até dias Depende muito das condições ambientais Escherichia Coli - 20 minutos Pisolithus microcarpus – 2,5 dias CRESCIMENTO MICROBIANO

22 O padrão de crescimento é o exponencial

23 Tratando-se bactérias, algas unicelulares e leveduras que se multiplicam por divisão binária, temos: 2 1 > 2 2 > 2 3 > 2 4 Onde N = n° microrganismos ao fim de n divisões N 0 é o número inicial O número de gerações será: A velocidade exponencial de crescimento (R) é expressa pelo número de divisões no tempo: A recíproca de R é o tempo de geração: Essas equações não se aplicam a microrganismos filamentosos. Assim, é mais conveniente aplicar-se uma equação mais geral, onde se considera a variação da massa (X), em função do tempo como sendo proporcional a concentração de biomassa presente:

24 Velocidade específica de crescimento: Num sistema fechado (cultivo batelada)- ocorre o aumento da concentração da biomassa. Assim, é necessário definir uma velocidade de crescimento que considere a quantidade de biomassa presente. A integração dessa equação diferencial fornece a equação algébrica do crescimento exponencial da biomassa: Ou escrita de outra forma: Tempo de duplicação: considerando que X = 2.X 0i, resulta :

25 O estudo cinético de um cultivo microbiano consiste da análise da evolução dos valores de concentração de um ou mais componentes do sistema, em função do tempo de cultivo. Componentes: microrganismo, nutrientes, metabólitos

26 O ciclo de crescimento A fase exponencial reflete apenas uma parte do ciclo de crescimento de uma população microbiana O crescimento de microrganismos em um recipiente fechado (batelada) apresenta um ciclo típico com todas as fases de crescimento.

27 1)Fase Lag Período de adaptação da cultura Mudança de meio, preparação do complexo enzimático Reparação das células com danos. 2) Fase exponencial Fase mais saudável das células onde todas estão se dividindo. A maioria dos microrganismos unicelulares apresentam essa fase, mas as velocidades de crescimento são bastante variáveis: - Procarióticos – crescem mais rapidamente que os eucarióticos - Eucarióticos menores crescem mais rapidamente que os maiores

28 3) Fase estacionária: Num sistema fechado (tubo, frasco ou biorreator) o crescimento exponencial não pode ocorrer indefinidamente. Ocorre a limitação por depleção de nutrientes e acúmulo de metabólitos. Divisão = morte crescimento líquido nulo Ainda pode ocorrer: catabolismo e produção de metabólitos secundários 4) Fase de morte (declínio): A manutenção de uma cultura no estado estacionário por longo tempo conduz as células ao processo de morte. - A morte celular é acompanhada da lise celular

29 MEDIDAS DO CRESCIMENTO MICROBIANO Podem ser realizadas pelos seguintes métodos: 1) Peso seco total das próprias células – filtração, secagem e pesagem 2) Peso de algum componente celular – extração, secagem e pesagem 3) Variação no número de células a) contagem de células totais b) contagem de células viáveis a) Contagem de células totais (contagem microscópica direta) Utilizam-se câmaras especiais de contagem (lâmina com grade quadriculada) Ex.: Câmara de Neubauer

30 MEDIDAS DO CRESCIMENTO MICROBIANO – contagem direta Vantagens: método rápido e fácil Desvantagens Não distingue as células vivas das mortas Pode-se omitir células pequenas Células móveis precisam ser imobilizadas Entre outras.

31 MEDIDAS DO CRESCIMENTO MICROBIANO – contagem indireta b) Contagem de células viáveis: Contagem das colônias formadas em meio de cultura em placas.

32 Razões: Erros devido à junção de células na colônia Restrições podem fazer células viáveis não originarem colônias São empregadas várias diluições decimais porque é difícil prever o número de viáveis. É contada a placa com 30 a 300 colônias Diluição das suspensões celulares Amostras concentradas precisam ser diluídas

33 MEDIDAS DO CRESCIMENTO MICROBIANO - Outros métodos Turbidimetria As células dispersam a luz e quanto mais células mais turvo é o meio Pode ser medida com um espectrofotômetro O uso da turbidimetria exige a construção de uma curva padrão - Turbidez X quantidade de células

34 Contagem eletrônica


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