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Genômica e Proteômica Montagem de genomas.

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Apresentação em tema: "Genômica e Proteômica Montagem de genomas."— Transcrição da apresentação:

1 Genômica e Proteômica Montagem de genomas

2 Introdução Queremos conhecer a seqüência de parte ou de todo o DNA de um organismo A tecnologia disponível só recupera pequenas seqüências de DNA. No máximo pb. Em média 450 pb Se queremos pedaços maiores de DNA, temos que a partir destas pequenas seqüências, montar um “quebra-cabeças” LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

3 Introdução Um tipo diferente de quebra-cabeças. Temos as peças, mas não sabemos o resultado final Freqüentemente, nem temos todas as peças É um problema computacional complexo! Como ? LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

4 Introdução Definir a estratégia de seqüenciamento Gerar as seqüências
Construção e validação de bibliotecas Seqüênciar Montar Finalizar a seqüência genômica LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

5 Estratégia de seqüenciamento
Clone-by-clone (“Primeiro mapear, depois seqüênciar”) Whole-genome shotgun sequencing Hybrid shotgun sequencing Expressed Sequence Tag - EST LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

6 Clone-by-clone e Whole-genome shotgun sequencing
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7 Whole-genome shotgun sequencing
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8 Whole-genome shotgun sequencing
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9 Hybrid shotgun sequencing
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10 Expressed Sequence Tag
B1 B2 C1 C2 C3 EST gene genoma Mensagem (ou transcrito) Splices alternativos do mesmo gene LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

11 Bibliotecas Em qualquer estratégia temos que construir bibliotecas de seqüências de DNA As bibliotecas devem ser validadas. Garantir: Que as seqüências tenham o tamanho esperado Que não exista contaminação e presença excessiva de vetores Que a distribuição das seqüências seja a esperada Para EST as bibliotecas podem ser de diferentes tecidos LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

12 Bibliotecas LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

13 Administração e gerência
No caso de redes de seqüenciamento, recepcionar os cromatogramas Armazenar os cromatogramas Gerar relatórios sobre o seqüenciamento Divulgação de estatísticas sobre o desenvolvimento do projeto LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

14 Administração e gerência
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15 Administração e gerência
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16 Administração e gerência
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17 Estratégia híbrida Leitura dos cromatogramas  converter os dados provenientes de seqüenciadores (reads) em seqüências de nucleotídeos, associando a cada um o seu respectivo valor de qualidade Montagem  comparar as seqüências, utilizando também os valores de qualidade, para encontrar a sobreposição entre elas e gerar as seqüências de consenso, chamadas contigs Objetivo: Um contig !!! LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

18 Estratégia híbrida Analisar a montagem
Acompanhar a evolução do número de contigs  Determinar quando se deve parar o seqüenciamento de bibliotecas e/ou iniciar o processo de finalização do genoma Identificar problemas de montagem. Ex.: Presença de repetições gerando montagens erradas LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

19 Estratégia híbrida Finalizar o genoma
Ordenar e orientar os contigs (scaffold) Utilizar os clones de shotgun e de outras bibliotecas (cosmídoes, bacs etc) para construir os scaffolds Definir estratégias específicas para fechar “gaps” – espaços entre contigs – no genoma Garantir que todas as bases tenham um valor mínimo de qualidade, para que tenhamos no máximo uma base errada em um milhão. LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

20 Leitura dos cromatogramas
A leitura dos cromatogramas é a realizada pelo programa phred O phred nomeia cada base e atribue um valor de qualidade para cada base lida A qualidade está relacionada a probabilidade que tenha ocorrido um erro na nomeação da base LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

21 Leitura dos cromatogramas
Q = -10 log10( Pe ) Q  Qualidade e Pe  Probabilidade de erro Ex.: 1 erro em 100 bases Q = -10 log10(1/100)  Q = 20 Ex.: 1 erro em bases Q = -10 log10(1/10000)  Q = 40 Ex.: 1 erro em bases Q = -10 log10(1/ )  Q = 60 LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

22 Leitura dos cromatogramas
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23 Leitura dos cromatogramas
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24 Leitura dos cromatogramas
O phred gera um arquivo contendo as bases e as respectivas qualidades LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

25 Filtragem de vetores Trechos de seqüências de DNA correspondentes a vetores devem ser filtradas Utiliza-se um programa (cross_match) de alinhamento de seqüências para procurar na seqüência de cada fragmento a presença do vetor O trecho correspondente tem cada uma de suas base substituídas por “x” LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

26 Filtragem de vetores LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

27 Montagem Determinar a ordem e orientação de uma coleção de fragmentos de um mesmo DNA Fragmento ATAGACCCAT GACCCAT ATGCATGCCATA CCAT GACTGCCATA CCATGCATG Alinhamento ---GACCCAT ATGCATGCCATA ------CCAT GACTGCCATA ------CCATGCATG ATAGACCCATGCATGCC Consenso LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

28 Montagem LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

29 Programas / pacotes de montagem
Assembler (www.tigr.org) Bambus – Programa para gerar scaffold CAP3 (genome.cs.mtu.edu) phred/phrap/consed (www.phrap.org) Staden (www.mrc-lmb.cam.ac.uk) – GAP4 Pode utilizar o CAP3 ou o phrap LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

30 CAP3 Identificação e remoção de regiões de baixa qualidade, no início e no fim dos reads Alinhamento entre reads para identificação de sobreposição Identificação e remoção de falsos alinhamentos LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

31 CAP3 Formação dos contigs através da junção dos reads em ordem decrescente da pontuação dos alinhamentos Correção nos contigs através da validação forward-reverse Alinhamento múltiplo dos reads para a construção da seqüência de consenso Geração dos arquivos de saída (links, ace etc) LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

32 phrap Tratamento das seqüências
Conversão de trechos de bases iguais, no início e no fim dos reads em “N” Identificação e exclusão de reads iguais Exclusão de regiões, provavelmente não filtradas, de vetores do alinhamento Determinação dos singlets (reads que não tem alinhamento com nenhum outro read) LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

33 phrap Identificação de sobreposição Formação dos contigs
Determinação do consenso Determinação dos links entre contigs e do scaffold Geração dos arquivos de saída (log, ace, contigs etc) LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

34 Pipeline da montagem Entrada: cromatogramas Base-calling
(phred) – phd_file Conversão (phd2fasta) phd_files  multifasta e multifasta.qual Montagem (phrap / cap3) Filtragem (cross_match) de vetores e repetições  multifasta.screen Arquivo de * Clones (formcon)  multifasta.screen.con LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004 * Somente para o CAP3

35 Análise da montagem LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

36 Análise da montagem Contig 1 Contig 4 Contig 5 b P12 g b P2 g b P4 g
b C g b C g b P6 g b P3 g b P4 g b P5 g b P9 g b P10 g b P11 g b P12 g b C g b C g b C g b C g b C g LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

37 Análise da montagem LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

38 Análise da montagem LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

39 Identificação de repetições
Repetição trechos de DNA ao longo do(s) cromossomo(s) Se a repetição tiver um tamanho próximo ou maior que a média do tamanha dos reads, o programa de montagem pode colocá-lo em uma região errada LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

40 Identificação de repetições
Repetições ambíguas A B C D LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

41 Identificação de repetições
Repetições colapsadas A B C LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

42 Identificação de repetições
Como identificar: Regiões de contigs que “empilham” reads Regiõe(s) que têm match com outras regiõe(s) Regiões que apresentam links de pontas de clones inconsistentes Regiões em que existem mais de um read com bases discrepantes em relação ao consenso LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

43 Identificação de repeats
Regiões que “empilham” reads LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

44 Identificação de repeats
Regiõe(s) que têm match com outras regiõe(s) LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

45 Identificação de repeats
Regiõe(s) que têm match com outras regiõe(s) LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

46 Identificação de repeats
Regiões que apresentam links de pontas de clones inconsistentes LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

47 Identificação de repeats
Regiões em que existem mais de um read com bases discrepantes em relação ao consenso LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

48 Problemas nos contigs Low Consensus Quality (LCQ)  É uma região do consenso, cujas bases possuem qualidade menor ou igual a 25. Indica uma região que está coberta por reads de baixa qualidade. High Quality Discrepancies (HQD)  São bases de um read que estão discrepantes em relação ao consenso e são de qualidade superior a 40. Positions not Confirmed on both Strands (NCBS)  Posições no consenso que não estão confirmadas nas duas fitas. Reads quiméricos LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

49 Problemas nos contigs - LCQ
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50 Problemas nos contigs - HQD
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51 Problemas nos contigs - HQD
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52 Problemas nos contigs - NCBS
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53 Problemas nos contigs - Quimera
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54 Finalização do genoma Estratégias para resolver os problemas de montagem dos contigs (LCQ, HQD, NCBS, quimeras) Estratégias para resolver os problemas de repetição  Fechar os gaps gerados pelos filtros Estratégias para fechar os demais gaps. Gaps dentro de scaffolds (virtuais) e entre scaffolds (reais) LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

55 Finalização do genoma -- HQD
Retirar os reads que contenham HQD, remontar o contig isoladamente e comparar as seqüências Retirar o(s) read(s)s que determina(m) o consenso, remontar o contig isoladamente e comparar as seqüências (muitos reads e muitas bases com HQD) Ressequenciar reads da região LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

56 Finalização do genoma – LCQ e NCBS
Ressequenciar reads que estejam com baixa qualidade Desenhar e sequenciar reads de primer Gerar uma subblioteca de um clone e sequenciá-lo completamente. LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

57 Finalização do genoma – Quimeras
Retirar os reads quiméricos . Realizar a montagem isolada e comparar os consensos Se houver diferença, ressequenciar reads da região, inclusive o quimérico LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

58 Finalização do genoma – fechamento de gaps
Ressequenciar reads que estejam com baixa qualidade nas extremidades dos contigs Desenhar e sequenciar reads de primer Gerar uma subblioteca de um clone e sequenciá-lo completamente. LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

59 Finalização do genoma – fechamento de gaps (filtro)
Montar separadamente os dois contigs de cada gap, ou apenas, as duas extremidades. Pode ser necessário montar com diferentes programas (cap3 e phrap) para estabelecermos comparações Garantir que, na medida do possível, os clones estejam com as duas pontas (forward e reverse). Resgatar, para isto, as pontas que se tornaram singlets LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

60 Finalização do genoma – fechamento de gaps (filtro)
Realizar experimentos que confirmem que os dois contigs do gap realmente estão juntos e na orientação indicada pelo scaffold (Ex. PCR combinatório) Desenhar e sequenciar reads de primer Gerar uma subblioteca de um clone e sequenciá-lo completamente. Sequenciar o produto de PCR LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

61 Genomas montados no LABINFO
Chromobacterium violaceum e Mycoplasma synoviae (www.brgene.lncc.br) Mycoplasma hyopneumoniae J e Mycoplasma hyopneumoniae 7448 (www.genesul.lncc.br) LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

62 Genomas em andamento no LABINFO
Xylella fastidiosa Ann1 e Xylella fastidiosa Dixon (www.xylella.lncc.br) Rhizobium tropici (www.nbf.lncc.br) Leifsonia xyli cynodontis (www.leifsonia.lncc.br) LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

63 EST A montagem de EST, é na verdade, a construção de clusters (grupos) de seqüências de EST que são originadas da expressão de um mesmo gene O pipeline é semelhante a montagem de genomas completos. Com exceção da filtragem de repeats. Tanto o programa CAP3, quanto o phrap podem ser utilizados LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004

64 Referências Green, ED – Strategies for the systematic sequencing of comples genomes (Nature Reviews – Genetics, vol 2, agosto 2001, ) (http://www.nature.com/cgi-taf/DynaPage.taf?file=/nrg/journal/v2/n8/full/nrg0801_573a_fs.html) Huang, X e Madan, A – CAP3: A DNA Sequence Assembly Program (Genome Research) Telles, GP et all - Bioinformatics of the sugarcane EST project (Genetics and Molecular Biology, vol 24, n1-4, 2001) Telles, GP e Silva FR – Trimming and clustering sugarcane ESTs (Genetics and Molecular Biology, vol 24, n1-4, 2001) LABINFO – LNCC / MCT Agosto / 2004


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