Tecnologia do DNA recombinante I:

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1 Tecnologia do DNA recombinante I:
Análise de DNA e RNA Agradecimentos: Profa. Dra. Aline Maria da Silva Instituto de Química- USP Bibliografia: Recombinant DNA – James Watson & Michael Gilman Guia de Rotas na Tecnologia do Gene – Matthew Walker & Ralph Rapley Biologia Molecular Básica-Arnaldo Zaha

2 Análise de DNA e RNA a partir de células ou tecidos
Digestão com endonucleases de restrição Eletroforese em gel de agarose Southern Blot Northern Blot Microarrays de DNA (chips de DNA) Clonagem de genes Isolamento a partir de bibliotecas de genes Amplificação de genes através de PCR Determinação da seqüência de bases do DNA Sequenciamento de genomas completos Sequenciamento de genes expressos Mutagênese in vitro Expressão recombinante de genes Proteínas recombinantes Organismos transgênicos

3 Endonucleases de restrição
Haemophilus aegytius HaeIII 5’...G G C C...3’ 3’...C C G G...5’ Haemophilus haemolyticus HhaI 5’...G C G C...3’ 3’...C G C G...5’ Escherichia coli EcoRV 5’..G A T A T C...3’ 3’..C T A T A G...5’ EcoRI 5’.G A A T T C...3’ 3’.C T T A A G...5’ Nocardia otitidis- NotI 5’..G C G G C C G C..3’ caviarum ’..C G C C G G C G..5’

4 DNA-Ligases

5 Clonagem de um segmento de DNA (gene) em vetores
Fragmento de DNA Ligação enzimática: Ligase de DNA Vetor ou veículo de clonagem: -plasmídeo -bacteriófago -cosmídeo cromossomo artificial de bactéria (BAC) cromossomo artificial de levedura (YAC)

6 construção inserto fragmento de DNA ligado ao vetor
introduzir nas células: transformação e seleção bactéria transformada

7 Clonagem de DNA em bactérias

8 Detecção e análise de ácidos nucleicos

9 Eletroforese em gel de agarose

10 Brometo de Etídio

11 Fotografando um gel de agarose corado com Brometo de Etídio
Camera Polaroid Gel Transiluminador com luz UV

12 Digestão de um plasmídeo com enzimas de Restrição
Marcador de tamanho (pb) Marcador de tamanho (pb) Digestão de um plasmídeo com enzimas de Restrição Digestão de DNA genômico com enzimas de Restrição

13 Mapa de restrição

14 Digestão de um plasmídeo com enzimas de Restrição
Marcador de tamanho (pb) Marcador de tamanho (pb) Digestão de um plasmídeo com enzimas de Restrição Digestão de DNA genômico com enzimas de Restrição

15 Transferência de ácidos nucleicos do gel para membrana de náilon (Blot)
Peso de 0,3-0,5 Kg Membrana Papel toalha Papel Filtro Gel Ponte de papel Reservatório com tampão de transferência

16 Hibridização de DNA (ou RNA) detecta se a solução contem sequencias complementares as fitas imobilizadas no filtro

17 Southern Blot: DNA x DNA
Hibridização da membrana com sonda radioativa Eletroforese do DNA em gel de agarose Exposição a filme de Raios-X Transferência para membrana

18 Produção de sondas gênicas para hibridização
Marcar fragmento radioativamente para geração de uma sonda para hidridização

19 Marcação da sonda através da síntese in vitro com nucleotídeos radioativos (32P-dATP)

20 Produção de sondas gênicas para hibridização a partir da sequência conhecida de um peptídeo

21 Marcação da sonda com 32P na extremidade 5´(32P ATP)

22 Detecção de genes expressos
Northern Blot RT-PCR (PCR precedido de transcrição reversa) Análise do nível de expressão de um único gene de cada vez Macroarrays de DNA Microarrays de DNA Análise do nível de expressão de milhares de genes simultâneamente

23 Northern Blot: RNA x DNA
Hibridização da membrana com sonda radioativa Eletroforese de RNA em gel de agarose Exposição a filme de Raios-X Transferência para membrana

24 Gel de Agarose Northern Blot 0h h 28S 18S Sonda Gene A

25 Gel de Agarose Northern Blot 0h h 28S 18S Sonda Gene B

26 Macro e microarrays de DNA
Arranjo ordenado de fragmentos de DNA imobilizados em uma superfície sólida porosa (membrana de náilon) ou não porosa (lâmina de vidro, plástico). Os “pontos” neste arranjo correspondem a um gene específico. É possível fabricar microarranjos com MILHARES de “pontos” em alta densidade

27 Tipos de microarrays de DNA
DNA purificado (plasmídeo/ produtos de PCR/ oligonucleotídeos) imobilizados em membrana de nylon ou plástico em alta densidade (ex: sequências de 8000 genes em membrana de 8 x 12cm, Clontech) DNA microarrays em vidro: Fragmentos de DNA obtidos por PCR (500~5.000 pb) ou oligonucleotídeos imobilizados em lâmina de vidro (lâmina de microscópio) com um “spotter” robotizado [~1995, grupo de Pat Brown, Stanford] GeneChip®: Oligonucleotídeos (20~25-mer) sintetizados in situ (on-chip). Estes são conhecidos como “DNA chips” e foram desenvolvidos pela Affymetrix em 1994.

28 Principal aplicação da tecnologia de microarrays de DNA
Determinação do nível de expressão de milhares de genes simultaneamente (abundância dos respectivos mRNAs) Avaliação global da expressão gênica em células, tecidos e organismos em diferentes situações fisiológicas e patológicas Classificação molecular de tumores – diagnóstico e prognóstico Farmacogenômica/Toxicogenômica

29 250.000 probes (“features”) representando 5.000 genes humanos
GeneChip (oligoarray) “Wafer” 12,7cm probes (“features”) representando genes humanos Oligos ( cópias) / feature Síntese fotoquímica in situ feature

30 “microarray de DNA em lâmina de vidro”
Amostras de DNA (produtos de PCR purificados) Deposição na lâmina de vidro com um robô (spotter) Imobilização covalente Arranjo ordenado e preciso das amostras de DNA em alta densidade

31 Microarrays de DNA DNA clones/PCR mRNA/cDNA Labelling Data Analysis
control sample 100000 200000 300000 400000 500000 600000 700000 800000 900000 ID Cye 3 Cye 5 This diagram show s the process of 2 color gene expression analysis on microarrays: 1. Clones in a gene expression library are PCR amplified, and purified for deposition onto specially coated slides. 2. mRNA is then purified from 2 cell samples, labeled in a first strand cDNA synthesis, and 3. Hybridized to the slide. The slide is then scanned 4. And the resulting image is quantitated and analyzed.

32 O genoma completo da levedura S.cerevisiae em um chip ~6.000 genes

33 Bloco 11 inferior, sala 1100 – IQ/USP

34 Tecnologia do DNA recombinante II: Clonagem de genes
Bibliotecas de DNA Agradecimentos: Profa. Dra. Aline Maria da Silva Instituto de Química- USP Bibliografia: Recombinant DNA – James Watson & Michael Gilman Guia de Rotas na Tecnologia do Gene – Matthew Walker & Ralph Rapley Biologia Molecular Básica-Arnaldo Zaha

35 Purificação e análise de DNA e RNA a partir de células ou tecidos
Digestão com endonucleases de restrição Eletroforese em gel de agarose Southern Blot Northern Blot Microarrays de DNA (chips de DNA) Clonagem de genes Isolamento a partir de bibliotecas de genes Amplificação de genes através de PCR Determinação da seqüência de bases do DNA Sequenciamento de genomas completos Sequenciamento de genes expressos Mutagênese in vitro Expressão recombinante de genes Proteínas recombinantes Organismos transgênicos

36 Construção de Bibliotecas de Genes
Bibliotecas Genômicas representam todo o genoma Bibliotecas de cDNA representam os genes expressos em um tecido ou situação fisiológica ou patológica

37 Clones genômicos Clones de cDNA

38 Biblioteca Genômica construída em bacteriófago

39 Biblioteca Genômica construída em bacteriófago

40 Varredura de Bibliotecas construídas em bacteriófago com sondas radioativas

41 Hibridização de colônias de bactérias
Varredura de Bibliotecas construídas em plasmídeo Hibridização de colônias de bactérias

42 Estratégia de sequenciamento do genoma
Whole genome shotgun Figure 2 Idealized representation of the hierarchical shotgun sequencing strategy. A library is constructed by fragmenting the target genome and cloning it into a large-fragment cloning vector; here, BAC vectors are shown. The genomic DNA fragments represented in the library are then organized into a physical map and individual BAC clones are selected and sequenced by the random shotgun strategy. Finally, the clone sequences are assembled to reconstruct the sequence of the genome. Nature 15 Feb (6822)

43 Construção de Biblioteca de cDNA
Clonar cDNAs em bacteriófagos ou plasmídeo

44 Varredura de Bibliotecas construídas em bacteriófago com sondas radioativas

45 Vetor de expressão

46 Varredura de Bibliotecas de expressão com anticorpos

47 Varredura de Bibliotecas de expressão com anticorpos

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