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Tecnologia do DNA recombinante BIOLOGIA MOLECULAR.

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Apresentação em tema: "Tecnologia do DNA recombinante BIOLOGIA MOLECULAR."— Transcrição da apresentação:

1 Tecnologia do DNA recombinante BIOLOGIA MOLECULAR

2 1.DNA recombinante 2.Enzimas de restrição 3.Vetores de clonagem - Plasmídios - Bacteriófagos - Cosmídeos 4. Etapas de clonagem molecular 5. Aplicações 1.DNA recombinante 2.Enzimas de restrição 3.Vetores de clonagem - Plasmídios - Bacteriófagos - Cosmídeos 4. Etapas de clonagem molecular 5. Aplicações Conteúdo

3 HISTÓRICO Watson & Crick Estrutura do química do DNA (1953) Nature, 25 - Abr Tecnologia DNA recombinante Insulina recombinante (1978) Ian Wilmut clonagem de mamífero (1997)

4 HISTÓRICO Prática clínica Testes genéticos ( ) PGH Conhecer genoma H. sapiens ( ) Transgenia ( )

5 O que é um DNA recombinante? - É uma molécula de DNA formada pela ligação de duas moléculas de origens diferentes (Ex. DNA de planta ligado a um plasmídio)

6 A engenharia genética atua no nível molecular, onde as diferenças entre espécies desaparecem

7

8 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

9 W. Alber H. SmithD. Nathans Uma enzima de restrição ou endonuclease de restrição é um tipo de nuclease que cliva fita dupla de DNA sempre que identificar uma seqüência particular de nucleotídios que seja o sítio de restrição da enzima; Descritas em 1970,

10 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Função Natural: proteger o DNA bacteriano do DNA exógeno

11 A enzima BamHI reconhece a seqüência dupla fita: ENZIMAS DE RESTRIÇÃO - reconhecem seqüências específicas de nucleotídeos no DNA, atuando como verdadeiras tesouras moleculares BamHI

12 BamHI - Bacillus amyloliquefaciens H 5 G/GATCC 3 EcoRI - Escherichia coli R 5 G/AATTC 3 HaeIII - Haemophilus aegyptius 5 GG/CC 3 PstI - Providencia stuartii 5 CTGCA/G 3 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Nomenclatura

13 37 0 C, 1 hora, com tampão adequado ENZIMAS DE RESTRIÇÃO EcoRI

14 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Tipos de cortes: - Produção de terminais coesivos (adesivos, protuberantes) - Produção de terminais abruptos (ou cegos)

15 NarI ~~~~~~ 181 ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGGCGCC TGGTATACGC CACACTTTAT GGCGTGTCTA CGCATTCCTC TTTTATGGCG TAGTCCGCGG 241 ATTCGCCATT CAGGCTGCGC AACTGTTGGG AAGGGCGATC GGTGCGGGCC TCTTCGCTAT TAAGCGGTAA GTCCGACGCG TTGACAACCC TTCCCGCTAG CCACGCCCGG AGAAGCGATA 301 TACGCCAGCT GGCGAAAGGG GGATGTGCTG CAAGGCGATT AAGTTGGGTA ACGCCAGGGT ATGCGGTCGA CCGCTTTCCC CCTACACGAC GTTCCGCTAA TTCAACCCAT TGCGGTCCCA HindIII PstI ~~~~~~~ ~~~~~~ 361 TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGCCAA GCTTGCATGC CTGCAGGTCG AAAGGGTCAG TGCTGCAACA TTTTGCTGCC GGTCACGGTT CGAACGTACG GACGTCCAGC XbaI BamHI KpnI EcoRI ~~~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~ ~~~~~~~ 421 ACTCTAGAGG ATCCCCGGGT ACCGAGCTCG AATTCGTAAT CATGGTCATA GCTGTTTCCT TGAGATCTCC TAGGGGCCCA TGGCTCGAGC TTAAGCATTA GTACCAGTAT CGACAAAGGA ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

16 TIPOS DE VETORES

17 Vetores Hospedeiros Plasmídeos Cosmídeos Bactérias / leveduras clonagem Bacteriófagos Utilização

18 Plasmídios são moléculas de DNA circular, fita dupla, extracromossomais, que ocorrem naturalmente em bactérias e algumas leveduras –pUC18 –pBR322 –pUP310 Ob.: Utilizados para clonar fragmentos de até 9 kb VETORES PLASMIDIAIS

19 Vetor de Expressão em Procarioto

20 VETORES PLASMIDIAIS Vetor de Expressão em Eucariotos

21 Vacina Vetorizada (rBCG)

22 Vetor de Expressão em Eucariotos VETORES PLASMIDIAIS

23 - Vírus que infectam bactérias; - Utilizados para clonar fragmentos de 9kb a 25 kb BACTERIÓFAGO

24 Ciclo Lítico Ciclo Lisogênico

25 - São híbridos entre plasmídios e bacteriófagos; - Utilizados para clonar fragmentos de 25 a 35 kb; COSMÍDEOS

26 Características essenciais Replicação autônoma Marcador de seleção (antibiótico) Sítio único de clonagem VETORES DE CLONAGEM

27 Necessitam de um promotor forte, de um RBS e de ATG Promotores induzíveis Sinais de secreção Fusão com proteínas carreadoras VETORES DE EXPRESSÃO

28 CLONAGEM MOLECULAR

29 É o isolamento e a propagação em um organismo de moléculas idênticas de DNA CLONAGEM MOLECULAR

30 CONSTRUÇÃO DE UM MICRORGANISMO RECOMBINANTE 1. Obtenção do DNA a ser clonado 2. Preparação do vetor 3. Ligação do vetor com o inserto 4. Transformação da bactéria 5. Seleção dos clones recombinantes

31 -Extração de DNA; -PCR -Digestão -Purificação 1.Obtenção do DNA a ser clonado

32 94 0 C por 5 min 94 0 C por 1 min 55 0 C por 1 min 72 0 C por 1 min 72 0 C por 5 min 4 0 C 35 ciclos PCR

33 Eletroforese em gel de agarose

34 Visualização do DNA em luz ultravioleta

35 Digestão Purificação 3.Preparação do vetor Plasmídeo Circular Plasmídeo linear Digestão com Enzimas de restrição

36 Extremidades coesivas Fragmento de DNA - inserto DNA plasmidial - vetor LIGASE 4. Ligação

37 CHOQUE TÉRMICO 5.Transformação da bactéria

38 ELETROPORAÇÃO

39 5.Transformação da bactéria ELETROPORAÇÃO

40 6.Seleção dos clones recombinantes

41 Construção do DNA Recombinante Molécula de DNA de um plasmídeo circular Clivagem com enzima de restrição Molécula de DNA de um plasmídeo linear com extremidades coesivas anelamento Ligação covalente pela DNA ligase Molécula de DNA plasmidial contendo o inserto Inserção em uma célula hospedeira

42 Extração de DNA de L. interrogans Leptospira interrogans meio EMJHExtração de DNA PCR 94ºC – 5 min 94ºC – 1 min 50ºC – 1 min 72ºC – 1 min 72ºC – 7 min 30 ciclos

43 PCR Clonagem em Vetores de expressão Transformação E. coli Seleção dos Clones recombinantes 768 pb Triagem Digestão Construção dos Vetores lipL pb Extração

44 Expressão de Proteínas Recombinantes Purificação da Proteína Cultura de Células Transformação da E. coli

45 Purificação de proteínas recombinantes Ligação Transformação por Eletroporação E. Coli DH5 Extração de DNA plasmidial pLysS codon pluss SI DE3 Transformação por Choque Térmico Cepas de E. coli para expressão de proteínas E. coli (BL21)

46 SDS-PAGE SDS-PAGE (Eletroforese de proteínas)

47 Expressão em diferentes cepas de E.coli Expressão de Proteínas Recombinantes

48 kDa 1.BENCHMARK TM Protein Ladder em kDa 2, 3 e 4. LipL32 purificada (eluições). Gel de poliacrilamida 15%. Purificação de Proteínas Recombinantes Akta Prime

49 APLICAÇÕES

50 VACINAS RECOMBINANTES 1. PCR 2. Clonagens 3. Multiplicação Proteína Recombinante 4. Vacinação Vetor Plasmidial L. interrogans pAE Vetor Plasmidial pTARGET pUS973 pUS974 pUS977 E.coli (BL21)E.coli TOP10 Vacina de DNA BCGr lipL32

51 ANIMAIS TRANSGÊNICOS

52 PLANTAS TRANSGÊNICAS


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