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MÉTODOS DE ESTUDOS EM BIOLOGIA CELULAR
I - MICROSCOPIAS
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M I C R O S P A
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Início (1600): - Incorporação do microscópio aos estudos anatômicos; - Desenvolvimento de técnicas de preparo para a visualização dos materiais biológicos 1663 Robert Hooke 1689 Marcello Malpighi 1750 1852
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(1689) Introdução da microscopia à medicina Estudo de capilares
Médicos: Rejeitaram microscopia – inútil Descrições sobre os capilares eram falsas Anatomia comparada era irrelevante para medicina Anatomia humana → só era útil para descrição Marcello Malpighi ( ) “ Nossa opinião é que a anatomia de uma estrutura sumamente pequena, interna de uma víscera, que foi exaltada nestes tempos, é de uso a nenhum médico”
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Interação da luz com o espécime
Fundamento: Sistema de lentes combinadas, que são colocadas de forma a ampliarem a imagem do objeto Interação da luz com o espécime Absorção ou Refração dos raios de luz Criar contrastes entre o objeto e o meio em que envolve
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Interação da luz com o espécime
Na formação da imagem aos Microscópios, dois fenômenos devem ser considerados: a absorção e a refração Interação da luz com o espécime
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produção de imagens aumentadas de objetos não visualizados à olho nú
Microscópio Principal instrumento da Biologia Celular e Histologia produção de imagens aumentadas de objetos não visualizados à olho nú 1) De luz (ML) / óptico (comum) Modificado (variações) com propósitos especiais Contraste de fase Invertido Polarização Fluorescência 2) Eletrônico (ME) - imagens mais aumentadas / feixe de elétrons Microscópio eletrônico de transmissão (MET) Microscópio eletrônico de varredura (MEV)
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(lâmpada com filamento de tungstênio)
Microscópio de luz comum / campo claro Componentes: Fonte luminosa → luz branca (lâmpada com filamento de tungstênio) Óptica → lentes ampliação condensação Mecânica Sistema de iluminação
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Os modelos microscópicos variam na forma e no desenho
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Princípios da formação da imagem ao Microscópio
Fonte de luz condensadora objetiva ocular objeto Imagem I Imagem II F C Fonte de luz → Lente condensadora → Lentes objetivas → Lente ocular O posicionamento estratégico das lentes no microscópio proporcionam a formação de uma imagem Invertida
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Trajeto da luz Centralização do feixe de luz “Iluminação de Köhler”
Iluminação perfeita Menos ocorrência de aberrações e irregularidades no trajeto luminoso
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Ocular (es) = imagem projetada pela objetiva
Objetiva (s) = próxima ao objeto Corrige aberrações = qualidade da imagem Tipos: acromática, semi-apocromática, apocromática, planacromática, planapocromática Projeta imagem real e invertida Aumentos: 4x / 10x / 20x / 40x / 100x (imersão) Ocular (es) = imagem projetada pela objetiva Aumentos: 10x, 12x
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Aumento final
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Objetiva 4x = Vermelha 10x = Amarela 40x = Azul claro
100x = Preta / branca
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Abertura numérico A = Ângulo de abertura da objetiva
= Ângulo correspondente à metade de A AN = Abertura numérica N = Índice de refração do meio de montagem sen = Fornecido pelo fabricante da lente AN = 0,12 (4x) AN = 0,34 (10x) AN = 0,60 (40x) AN = acima de 1 (100x) AN = n.senα
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Poder de Resolução X Limite de Resolução
Bom microscópio: 1) Poder de Resolução (PR): “Capacidade de uma lente (ou do próprio microscópio) em formar imagens com detalhes mínimos” 2) Limite de Resolução (LR): “Menor distância entre 2 pontos distintos do objeto, que poderão ser individualizados na imagem final” > PR < LR
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Quanto < o LR de uma lente > o PR do microscópio
ou Quanto melhor for a capacidade de individualizar 2 pontos distintos do objeto (< LR) maior será a definição da imagem formada no aparelho ( > PR)
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Planos de cortes
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Planos de cortes Imagem microscópio = bidimensional
Objeto de estudo = tridimensional
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Observação: imagem → invertida
Sequência de passos Leia a etiqueta da lâmina material / corte / coloração Examine a lâmina macroscopicamente pode-se obter muita informação Objetiva de menor aumento (panorâmica) Ajustar área a ser observada, centralizando-a na platina Iluminação de Köehler Objetivas de aumentos maiores Observação: imagem → invertida
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Tipos de Microscópios Microscopia de Luz Microscopia convencional
Microscopia de contraste de fase Microscopia de contraste interferencial Microscopia de campo escuro Microscopia de polarização Microscopia de fluorescência Microscopia confocal a laser Microscopia eletrônica Microscopia eletrônica de transmissão Microscopia eletrônica de alta voltagem Microscopia eletrônica de varredura Outros tipos de microscópio Microscopia de tunelamento quântico Microscopia de força atômica Microespectrofotometria
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Microscopia de Contraste de fase Princípios da Difração da Luz
Anéis metálicos colocados no caminho da luz (Zerniké, 1950) Objetivas de contraste de fase: Ph (Phase) Retardo óptico e Refração da luz
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Microscopia de Contraste de fase
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Aplicações da Microscopia de Contraste de fase
Análise do material biológico sem coloração prévia: 1.Culturas de células 2. Exames parasitológicos 3. Esfregaços e Raspagens de mucosas (Consultórios) 4. Sangue 5. Protozoários de ambientes aquáticos 6.Algas 7. Bactérias Diferenças de índices de refração Sem coloração Cultura de células: neurônios Bactérias
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Aplicações da Microscopia de Contraste de fase
Análise do material com coloração prévia Esfregaço de Sangue Divisão Celular em Raiz de Cebola
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Microscopia de Contraste Interferencial
Prismas ópticos posicionados no caminho da luz
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Microscopia de Contraste Interferencial
Os prismas modificam a fase da onda luminosa Contraste com o meio em que se encontra o material
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Microscopia de Contraste Interferencial
Microscopia de Normarski Defasagem dos comprimentos de onda Gera uma “deformação” na imagem Permite contraste interferencial Aumentando o relevo das superfícies do material analisado
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Aplicações da Microscopia de Contraste Interferencial
Observação de materiais biológicos sem coloração: 1. Parasitologia: Interpretação de estruturas e apêndices parasitos (taxonomia) 2. Análise de massa seca celular – organização e compactação de material biológico 3. Monitoramento de culturas celulares Algas Escamas
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Aplicações da Microscopia de Contraste Interferencial
Cultura Celular: macrófago Ácaro
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Princípios da formação da imagem ao Microscópio
Com coloração fluorescente Sem coloração Com coloração Diferenças de índices de refração Cores de interferência Campo escuro
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Microscopia de Polarização
2 Filtros / Prismas: 1º Polarizador → Entre a fonte de luz e o condensador 2º Analisador → Entre a objetiva e a ocular Promovem a seleção de apenas um plano de direção de vibração das ondas luminosas Plano da luz polarizada (PLP) Observação: Microscopia de luz comum → feixe de ondas luminosas → direção de vibração em todos os planos
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Microscopia de Polarização
2º 1º
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Microscopia de Polarização
2º 1º PLP
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Anisotropias Ópticas Fenômenos de ordem espectral
Birrefringência (2 filtros polarizadores cruzados perpendiculares) Dicroísmo (1 filtro polarizador)
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Microscopia de Polarização
Filtros polarizadores, quando colocados no caminho da luz e rotacionados a 90o permitem a distinção de macromoléculas ditas anisotrópicas (birrefingentes ou dicróicas)
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Componentes macromoleculares birrefringentes Outros componentes
Birrefringência ocorre Cruzamos perpendicularmente os 2 filtros (polarizador e analisador) Componentes macromoleculares birrefringentes Anisotrópicos (brilho colorido ou não) Realçados Outros componentes Isotrópicos (não refrigentes) Indistintos em fundo escuro
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Aplicações da Microscopia de Polarização
1. Análise de macromoléculas que apresentam graus ordenados de agregação: DNA, colágenos fibrilares, celulose, tubulina 2. Análise de células que apresentem organização interna de suas macromoléculas altamente cristalinas: célula muscular esquelética, espermatozóides (ordem molecular) 3. Análise de tecidos biológicos com ordem molecular nos arranjos macromoleculares: tecidos ósseos, cartilagens, dente 4. Análise de componentes cristalinos dos minerais 5. Outros: parede celular; amido.
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Aplicações da Microscopia de Polarização
Tecido ósseo Grãos de Amido
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Birrefringência pode ser intensificada por corantes
Exemplos: Colágeno - Xylidine Ponceau - Picro-sirius Cromatina / Matriz Extracelular - Azul de toluidina (ordem e agregação molecular ) Birrefringência pode ser intensificada por corantes
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Aplicações da Microscopia de Polarização
Coloração: Picro-sirius / Luz polarizada Tecido ósseo : sistema de Havers ou ósteon / fibras colágenas Tecido ósseo: osso esponjoso / fibras colágenas
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Microscopia de Luz Polarizada
Mesentério de rato. Coloração: Picro-sirius (fibras de colágeno: intensa birrefringência / brilhante / amarelo)
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Material biológicos Birrefringência dependendo do grau de agregação de cristalinidade Medida das propriedades anisotrópicas (dicroísmo e birrefringência) Diagnósticos patológicos Estabelecimento ordem molecular Fases da vida celular
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Microscopia de Campo Escuro
Os microscópios de campo escuro apresentam um tipo especial de condensador - inclina a luz de tal modo que ela não atravessa o objeto A luz se dispersa Apenas os feixes desviados pelo objeto percorrem o resto do sistema (objetivas e oculares)
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Aplicações da Microscopia de Campo Escuro
É empregada para estudos de pequenos materiais: Plâncton Bactérias Cristais Estruturas subcelular (fimbrias e flagelos) Grãos de pólen Microscopia de campo escuro da bactéria Leptospira spp
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Microscopia de Fluorescência
Propriedade física de algumas substâncias absorverem a luz em um determinado comprimento de onda e emitirem luz com comprimentos de onda maiores e níveis energéticos mais baixos Microscopia de fluorescência mostrando uma célula embrionária de Caenorhabditis elegans em divisão
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Fluorescência natural: Lignina de parede vegetal
Existem componentes celulares ou moleculares naturalmente fluorescentes Clorofila Lignina de parede vegetal Elastina Colágeno A fluorescência visível neste nudibranqueo é dupla: os pigmentos verdes próprios da lesma e as algas vermelhas no seu intestino Algas (clorofila)
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Alaranjado de acridina
Outros componentes: Se ligam a substâncias fluorescentes → fluorocromos → emitem brilho contra fundo escuro Alaranjado de acridina (fluorocromo) DNA - verde RNA - vermelho Células do testículo de triatomíneos (barbeiro) Divisão celular
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Microscopia de Fluorescência 1. Sistema óptico interage com pouca luz:
Luz de mercúrio de alta pressão 2. Sistemas de filtros para detectar o brilho do material contra o fundo negro (a. Filtro de excitação; b. Filtro de barragem) Fonte de luz → Fótons → Filtro de excitação (seleciona os fótons de determinado comprimento) → Objeto → Emite luz fluorescente → Filtro de barragem (luz de excitação é bloqueada) → Imagem observada (formada pela luz que atravessa o filtro de barragem) b. Filtro de barragem Ocular a. Filtro de excitação Fonte de luz Objetiva
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Microscopia de Fluorescência
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Aplicações da Microscopia de Fluorescência Alaranjado de acridina
Devido a especificidade de cada tipo de filtro e devido ao desenvolvimento de vários corantes (fluorocromos) → muitas são as utilizações da microscopia e fluorescência Fluorocromos: Alaranjado de acridina Eosina DAPI Rodamina Fluoresceina Emitem brilho contra fundo escuro
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Outras aplicações da Microscopia de Fluorescência
Quantificação (Fluorometria): citoquímica normal e patológica Imunofluorescência: conjugação de anticorpos a fluorocomos que permite identificação de moléculas específicas Imunocitoquímica Hibridação “in situ” (FISH)
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Aplicações da Microscopia de Fluorescência
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Microscopia confocal a laser
Disponível mundialmente O microscópio confocal tem seu funcionamento baseado nos princípios da microscopia de fluorescência → Utiliza laser como fonte de luz Permite a visualização: materiais espessos; corpos inteiros sem coloração prévia (vivos ou pré-fixados) Reconstrução do objeto tridimensionalmente → Vários planos focais ou cortes ópticos (programas computacionais)
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Aplicações da Microscopia confocal a laser
1. Todas as possibilidades já descritas para a microscopia de fluorescência convencional 2. Reconstrução 3-D de organismos microscópicos 3. Aumento de sinais de fluorescência de estruturas subcelulares. Exs: microtúbulos, miofilamentos, filamentos intermediários e elementos finos da matriz extracelular
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Aplicações da Microscopia confocal a laser
Células em prófase Células em apoptose: condrócitos
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Aplicações da Microscopia confocal a laser
Protozoário Macrófago
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Aplicações da Microscopia confocal a laser
Divisão celular / Fuso mitótico Grãos de Pólen
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Microscopia eletrônica Semelhantes a fótons num sistema de vácuo
Início: Estudos do comportamento ondulatório dos elétrons Semelhantes a fótons num sistema de vácuo Primeiros experimentos: Década de 1920 → Busch (elétrons conduzidos por lentes eletromagnéticas) 1931 → Ruska → Primeiro M.E. → Poder de resolução: 0,5 nm → 25 mil vezes a capacidade do olho humano Ernst August Friedrich Ruska ( )
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Principais diferenças
Microscópio de luz (ML) Microscópio eletrônico de transmissão (MET) Fonte Luz (porção inferior) Elétrons (porção superior) Lentes Vidro Eletromagnéticas Lentes de aumento (principal) Objetivas e oculares Suporte para amostra Lâmina de vidro Grade de metal (telinha)Cobre ou níquel Limite de resolução 0,2 µ 0,0002 µ Formação da imagem Transparência e coloração Variações de densidade e contrastação
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Microscopia eletrônica Microscopia de Luz e Microscopia Eletrônica
Questões importantes: Ampliação e Resolução
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Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e
de Varredura (MEV) O avanço da microscopia eletrônica se deu a partir da descoberta de que os elétrons tinham comportamento ondulatório semelhante aos fótons de luz Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET) Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV)
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Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
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Microscópio eletrônico Microscópio eletrônico
de transmissão (MET) Microscópio eletrônico de varredura(MEV) Formação da imagem ao Microscópio eletrônico: Fonte de elétrons → Caminha por um sistema de lentes eletromagnéticas (coluna) → Feixe de elétrons → Acelerados → Lente condensadora → Amostra → Lentes objetivas (primeira imagem aumentada da amostra) → Lentes intermediarias / projetivas (formação final da imagem) → Imagem ampliada → Anteparo fluorescente / monitor
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Principais etapas da preparação das amostras para MET
Fixação Desidratação Inclusão Cortes Contrastação com metais pesados
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Imagem final ao MET Eletrodensa (escura) → os elétrons encontram elementos como: ferro, ósmio, chumbo, ouro etc Eletrolúcida (clara) → os elétrons encontram elementos como: hidrogênio, carbono, oxigênio, nitrogênio etc Observação: Contrastação do material biológico (maioria eletrolúcidos): metais pesados
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Microscopia Eletrônica de Transmissão
Coloração negativa: vírus Tecido muscular Células epiteliais Cílio Hepátócito: Complexo de Golgi
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Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
Scanning Electron Microscopy (SEM) Revela feições topográficas da superfície (detalhes) Imagens tridimensionais: - Vermes - Insetos - Células livres (animais/vegetais) - Embriões - Fragmentos geológicos Elétrons secundários / refletidos na superfície da amostra Guelras de um peixe
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Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Preparação das amostras
Fixação (glutaraldeído / tetróxido de ósmio) Desidratação Secagem (“ponto crítico”) Evaporação com ouro na superfície a ser analisada
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Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
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Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
Title: “An Army of One" Category: Photo Microscopy Photographer: Freder Medina
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Microscopia Eletrônica de Alata Voltagem ou Alta Aceleração
Descrição de estruturas subcelulares (µ) Ex.: Citoesqueleto Aparelho grande: equivalente a um edifício de três andares - Alta aceleração eletrônica (500 a KV) - Permite estudos de corte grossos - Reconstrução tridimensional
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Microscopia de Tunelamento Quântico
Década de 1980 Potência visual do olho humano: 1 milhão de vezes (100x a capacidade do MET) = Estrutura atômica Benning / Rohrer (1986): Prêmio Nobel de Física Corpos: - Características ondulatórias - Emissão de energia
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Microscopia de Tunelamento Quântico
Agulha que dista da superfície da amostra em 1Å Percorre a superfície da amostra → corrente elétrica (tunelamento) Corrente atrai elétrons do material para a agulha → “tunel” Agulha sobre um átomo → corrente ↑ Agulha sobre os espaços entre os átomos → corrente ↓ Esses sinais (↑ e ↓) são transmitidos para o computador → imagens ≈ à superfície de vales e montanhas
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Microscopia de Tunelamento Quântico
Molécula de miosina Cromossomos 1 milhão de Vezes (100x a capacidade do MET) = ESTURUTRA ATÔMICA
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Microscopia de Força Atômica
É semelhante ao Microscópio de Tunelamento Quântico Diferença: - Microespelho - Feixe de “laser” sobre a agulha Menor agressividade à amostra Detecção de detalhes de superfície Aplicações: - Imagens em solução - Sequências de reações químicas / modificações ao longo do tempo - Estrutura atômica de biomoléculas
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Microscopia de Força Atômica
Imagem de uma plaqueta obtida por microscopia de força atómica Imagem de eritrócitos obtida por microscopia de força atómica
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Brasileiro ganha prêmio internacional para imagens de microscopia de força atômica
Luciano Paulino da Silva, pesquisador da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, conquistou o segundo lugar na primeira edição do Prêmio Internacional de Imagens de Microscopia de Força Atômica. A imagem de autoria do pesquisador da Embrapa, que mostra a superfície das células vermelhas do sangue depois do tratamento com peptídeos antibióticos, foi a única imagem não européia premiada dentre as mais de 250 inscritas. O prêmio visa o reconhecimento da importância das imagens de microscopia para os avanços da nanotecnologia em todo o mundo. Reportagem publicada no dia 10/09/2007
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Fim Title: “Formosa Nano-Rose" Photographer: Dr. Kuei-Hsien Chen
Scanning electron Microscopy – imagem representa um único cristal de Wurtzite indium nitride (InN) sintetizado Fim Title: “Formosa Nano-Rose" Photographer: Dr. Kuei-Hsien Chen Vencedor do “Science as Art Contest” de 2008
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