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Microscopia de contraste diferencial de fase. Contraste: diferença de iluminação entre amostras e os arredores ou o plano de fundo. LUZ absorção Transmissão.

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1 Microscopia de contraste diferencial de fase

2 Contraste: diferença de iluminação entre amostras e os arredores ou o plano de fundo. LUZ absorção Transmissão = luz + fluorescência – (absorção + refração + reflexão) reflexão fluorescência refração Contraste diferencial de fase

3 Conceito Conceito Técnica de contraste em que a luz plana polarizada incidente sobre a amostra passa por diferentes caminhos ópticos em pontos diversos da amostra, causando diferenças de intensidade de luz que passam por um 2º polarizador. Os caminhos ópticos diferentes podem ser causados por diferenças nos índices de refração e/ou nas espessuras das estruturas. Os caminhos ópticos diferentes podem ser causados por diferenças nos índices de refração e/ou nas espessuras das estruturas. I = intensidade de luz do campo (f) ou da amostra (a). Contraste = (I f - I a ) x 100 I f Contraste diferencial de fase

4 Indicações Indicações - Amostras vivas ou fixadas não coradas; - Observação de células (incluindo organelas) em cultura: - Aplicar coloração óptica; - Melhorar contraste de certas estruturas em amostras coradas; - Aplicação da técnica de seccionamento óptico. Contraste diferencial de fase

5 Configurações Configurações 1) Tradicional (Normanski, 1952): usa prismas Wollaston e polarizadores. Também conhecida como conatrste de Normanski. 2) Alternativa (Inoué, 1989): usa polarizadores e compensadores de retardo de fase. Também conhecida como técnica DIC com compensador de fase. Pode-se usar compensador de Senarmont, compesador de Berek ou filtro com analisador giratório. Contraste diferencial de fase

6 O que o contraste diferencial faz? O que o contraste diferencial faz? -Variações nos caminhos ópticos dos raios desviados são ajustadas para dar um contraste com impressão de imagem tridimensional; - partes da amostra podem ficar mais escuras ou mais claras que o campo de visão ao redor. - não há halos de fase ao redor das células/estruturas; - produz melhor resolução do que o contraste de fase pela ausência dos anéis de fase nas objetivas e condensador; - há formação de sombras acompanhando um eixo no plano da imagem. Contraste diferencial de fase

7 Configuração tradicional Configuração tradicional Trabalha-se nos planos da imagem conoscópica Contraste diferencial de fase Analisador Wollaston Filtro 1/4 Polarizador

8 Configuração alternativa (de Senarmont) Configuração alternativa (de Senarmont) Objetiva Analisador Polarizador giratório Filtro ¼ de Amostra Fonte de luz Diafragma do condensador Compensador de Senarmont: Consiste num filtro ¼ de e um polarizador (pode ser o analisador) giratório. Contraste diferencial de fase

9 Analisador Fenda para inserir filtro Escala vernier Graduação de 180 ou 360º Trava Configurações de compensador de Senarmont Configurações de compensador de Senarmont (a) Controle Giratório removível Filtro de ¼ de Analisador (b) Contraste diferencial de fase

10 Configuração alternativa (de Senarmont) Configuração alternativa (de Senarmont) 1) Faz-se ajuste koehler; 2) coloca-se polarizadores cruzados, com o 1º na posição 45º e o 2º a 90º do 1º (campo de visão fica escuro); 3) Insere-se o filtro ¼ de na fenda apropriada; Contraste diferencial de fase

11 Configuração alternativa (de Senarmont) Configuração alternativa (de Senarmont) 4) Gira-se o analisador até criar um retardo de fase adequado para se obter o melhor contraste para cada caso. O retardo de fase é dado por: * /180 ( é o angulo movido no analisador). 4) Gira-se o analisador até criar um retardo de fase adequado para se obter o melhor contraste para cada caso. O retardo de fase é dado por: * /180 ( é o angulo movido no analisador). Contraste diferencial de fase

12 Configuração alternativa (de Senarmont) Configuração alternativa (de Senarmont) 5) Pode-se inserir um filtro vermelho 1 (entre o polarizador e a amostra ou entre a objetiva e o analisador) para fazer coloração óptica. 5) Pode-se inserir um filtro vermelho 1 (entre o polarizador e a amostra ou entre a objetiva e o analisador) para fazer coloração óptica. Contraste diferencial de fase

13 Configuração alternativa (de Senarmont) Configuração alternativa (de Senarmont) É mais prática que a configuração tradicional e está sendo responsável pela crescente popularidade da técnica de DIC. É mais prática que a configuração tradicional e está sendo responsável pela crescente popularidade da técnica de DIC. Contraste diferencial de fase

14 Eixos das sombras Eixos das sombras Contraste diferencial de fase

15 Dados técnicos Dados técnicos 1) A cessórios obrigatórios (método alternativo): dois polarizadores (sendo um deles giratório) e um filtro de ¼ de ou filtro ou compensador de Berek. 2) Acessórios extras (método tradicional): prismas Wollaston (no diafragma do condensador e perto do plano retro-focal da objetiva) (para a técnica clássica de DIC). Contraste diferencial de fase

16 Técnicas e contraste Técnicas e contraste AmostraTécnicaContraste TransparenteCampo claro2-5% CoradaCampo claro25% TransparenteContraste de fase15-20% TransparenteContraste diferencial de interferência15-20% TransparenteCampo escuro60-75% TransparenteFluorescência60-75% Contraste diferencial de fase

17 Sem filtro vermelho 1 Com filtro vermelho 1 Técnica de coloração óptica Técnica de coloração óptica

18 Secionamento óptico Secionamento óptico É a técnica de observar planos específicos da amostra separadamente, trabalhando com o ajuste micrométrico em certas técnicas de contraste. É a técnica de observar planos específicos da amostra separadamente, trabalhando com o ajuste micrométrico em certas técnicas de contraste. Contraste diferencial de fase Observação de diversos planos de uma colônia de Volvox (microorganismos aquáticos)

19 Contraste de fase DIC Contraste diferencial de fase Contraste de fase x DIC: diferenças Contraste de fase x DIC: diferenças


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