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1 Polymerase Chain Reaction (PCR) Pedro Teiga Ricardo Ladeiras Sofia Marques 21 Abril 2005.

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1 1 Polymerase Chain Reaction (PCR) Pedro Teiga Ricardo Ladeiras Sofia Marques 21 Abril 2005

2 2 A invenção da PCR 1983 Kary Mullis º paper 1993 Nobel da Química

3 3 PCR, a ferramenta do futuro Grande quantidade de DNA em pouco tempo. Baixo custo A amostra de DNA não necessita de estar altamente purificada. PCR pode amplificar uma única molécula de DNA / RNA. O produto do PCR pode ser digerido com enzimas de restrição, sequenciado ou clonado.

4 4 A reacção

5 5 O que envolve a reacção? DNA Template Tampão da reacção (Tris, iões amónio (e/ou iões de potássio), iões de magnésio soro de albumina de bovino) Nucleótidos (dNTPs) Primers DNA polymerase (pex: Taq, Pfu)

6 6 Quantos ciclos?

7 7 Termo-Cicladores

8 8 Funcionou? Se não…o que fazer?

9 9 Optimização da reacção de PCR Temperatura Tempos Concentração de Mg 2+ na reacção. Quantidade de template e de polymerase

10 10 DNA polimerases.. E. coli Taq Pfu – proofreading rTth DNA Polymerase

11 11 Fidelidade da reacção A Taq comete ERROS Qual a importância dos erros? Como superá-los?

12 12 Concepção dos PCR Primers Comprimento: especificidade vs eficácia Temp de annealing Composição de bases Extremidade 3 Regiões repetitivas do DNA Enzimas de restrição Estrutura secundária Homologias Intra e Inter-primer

13 13 Primers a formar Hairpins e Dímeros Complementaridade intra-primer – dobra em hairpin: Dímero de primers (intra ou inter primer).

14 14 Aplicações do PCR Multiplex PCR Real Time PCR PCR na detecção de polimorfismos e mutações patológicas PCR e a amplificação indiscriminada de sequências de DNA PCR na amplificação de sequências de DNA desconhecidas PCR assimétrico PCR e clonagem de DNA genómico PCR e clonagem de cDNA PCR e DNA Fingerprinting: casos da Biologia Forense e da Filiação genética

15 15 Multiplex PCR

16 16 Real time PCR

17 17 PCR usado na detecção de polimorfismos e mutações patológicas

18 18 Para detectar polimorfismos de local de restrição O que são polimorfismos? Porque existem os polimorfismos? Como se detectam esses polimorfismos?

19 19 PCR específico para um alelo e detecção de mutações Como se consegue discriminar entre duas sequências alvo que difiram num único nucleotídeo? Um só nucleotídeo faz a diferença? Como se interpretam os resultados?

20 20 Qual a vantagem? PCR permite amplificação indiscriminada de sequências de DNA

21 21 Linker-primed PCR Como decorre? O que é o linker? Que primers são usados?

22 22 Qual a vantagem? PCR usado para amplificar uma regiões desconhecidas que flanqueiam uma região previamente caracterizada

23 23 PCR inverso Quando se utiliza? Como são os primers? Como decorre o processo?

24 24 Os produtos amplificados do PCR são usados na sequenciação de DNA

25 25 PCR assimétrico Com que fim se utiliza? Porquê assimétrico?

26 26 Clonagem de DNA genómico Clonagem de cDNA

27 27 PCR e DNA Fingerprinting Exemplo: locus D1S80

28 28 PCR e DNA Fingerprinting Suas principais aplicações: Biologia forense (ex. confirmação do autor de um crime) Filiação genética (ex. testes de paternidade)

29 29

30 30 PCR e Filiação genética Pai Mãe

31 31 O futuro da PCR PCR material genético Fotocopiadora material escrito tornando a cópia fácil, barata, acessível

32 32 O futuro da PCR Com a técnica de PCR iremos desvendar o nosso passado genético, bem como abrir o caminho para um futuro geneticamente traçado.

33 33 Agradecimentos Este trabalho foi possível com a ajuda de.. Drª. Clara Monteiro Drª. Susana Pereira, IBMC Drª. Marta Pinto

34 34 Referências Tom Strachan, Andrew P. Read Human: Molecular Genetics;BIOS Scientific Publishers Limited; 1996; USA James D. Watson, Michael Gilman, Jan Witkwoski, Mark Zoller: Recombinant DNA; second edition; 1992; New York,Scientific American Books Geoffrey M Cooper: The Cell, a molecular approach; second edition Alkami quick guide tm for PCR Rui Pereira; Biologia forense; Nov 2004 A. Silva, A. Fonseca, C. Teixeira, E. Sousa; FCUP; Testes de paternidade Raymond Dalgleish; Department of Genetics; The Polymerase Chain Reaction (PCR) Site:


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