TERAPIA GÊNICA Profa. Dra. Ana Elizabete Silva

Apresentação em tema: "TERAPIA GÊNICA Profa. Dra. Ana Elizabete Silva"— Transcrição da apresentação:

1 TERAPIA GÊNICA Profa. Dra. Ana Elizabete Silva
Departamento de Biologia IBILCE - UNESP

2 TRATAMENTO DE DOENÇAS GENÉTICAS
Na maioria das vezes o tratamento das doenças genéticas é somente paliativo amenizando os sintomas ao invés de agir na causa primária: o gene

3 ESTRATÉGIAS TERAPÊUTICAS

4 Terapia Gênica Envolve diversas tecnologias que têm em comum, um novo conceito terapêutico a introdução de material genético para atuar na causa fundamental da doença : o gene, fragmento gênico ou oligonucleotídeos Descreve qualquer processo destinado a tratar ou aliviar doenças pela modificação genética das células do paciente.

5 FORMAS POTENCIAIS DE TERAPIA GÊNICA
germinativa somática

6 TERAPIA GÊNICA GERMINATIVA
Terapia gênica para a mutação little(lit): hormônio do crescimento Regulador-Promotor da Metalotioneína: remover metais pesados

7 TERAPIA GÊNICA DE CÉLULAS SOMÁTICAS
Terapia in vivo: as células são tratadas dentro do corpo Terapia ex vivo: as células do paciente são retiradas e manipuladas fora do corpo

8 TERAPIA GÊNICA IN VIVO

9 TERAPIA GÊNICA EX VIVO

10 1. Inserção de um gene em um vetor
2. Contato Vetor / Célula 3. Entrada e transporte do gene até o núcleo da célula 4. Transcrição do RNAm a partir do gene 5. Tradução do RNAm em proteína 6. Secreção, fixação na membrana ou expressão citoplasmática da proteína

11 PROCEDIMENTO BÁSICO PARA TERAPIA GÊNICA
Doença apropriada Estratégia de transferência: ex vivo ou in vivo Células alvo Vetor (Animação)

12 CÉLULAS ALVO Características: acessíveis, tempo de vida longo no corpo, alta taxa de proliferação Tipos de células alvo: Células tronco (medula óssea- cordão umbilical) linfócitos fibroblastos de pele células musculares (mioblastos) células vasculares endoteliais hepatócitos

13 Técnicas de introdução de genes em células de mamíferos:
A- Técnicas que utilizam métodos físicos ou químicos: baixa eficácia e transitório microinjeção de DNA eletroporação (choque elétrico) biobalística (gene gun) precipitado de fosfato de cálcio lipossomos

14 Sistemas Não-Virais: Microinjeções de DNA
Microinjeção: núcleo da célula (terapia ex vivo ou in vivo- embrião) utilizada principalmente no desenvolvimento de vacinas de DNA.

15 Sistemas Não-Virais: Eletroporação
- Pulsos elétricos curtos de alta voltagem; - Permeabilização da membrana celular; - Entrada na célula de diferentes tipos de moléculas, entre as quais os DNA. Eletroporação: choque elétrico→poros (morte celular) Fonte:

16 Sistemas Não-Virais: Microesferas – Biobalística ou Gene-Gun
Bombardeio partículas de ouro/ tungstênio conjugada ao DNA: bomba de hélio (morte celular)

17 Sistemas Não-Virais: Transfecção com Fosfato de Cálcio
- Método utilizado com sucesso para introduzir transgenes em células in vitro; - Não apropriado para aplicação in vivo. Precipitado c/DNA- endocitose (cultura celular – ex vivo)

18 Sistemas Não-Virais: Lipossomos
dupla camada lipídica englobando uma fração aquosa -complexo de DNA e lipídeos. Desvantagens: - Não possuem capacidade intrínseca de atravessar a membrana nuclear:1 em 1000 plasmídeos atinge o núcleo; - Grande maioria são levados ao sistema lisossômico. Fonte:

19 Técnicas de introdução de genes em células de mamíferos:
B- Técnicas que utilizam vetores biológicos: retrovírus (RNA) Adenovírus (DNA) Adenovírus associado-AAV (parvovírus) Lentivírus (retrovírus → cels. não dividem) Herpes vírus (invadir neurônios) Cromossomo artificial

20 RETROVÍRUS Retrovírus (vírus de RNA) são os vetores ideais para a transferência de genes em células humanas: são capazes de infectar quase 100% das células-alvo em divisão→ integra no genoma hospedeiro carregam fragmentos relativamente grandes de DNA (8kb) Desvatagem: infectam somente células em divisão

21 RETROVÍRUS Genes retrovírus: Gag: proteína cápsula interna
Env: transcriptase reversa e integrase Pol: envelope glicoproteína Fonte:

22 INSERÇÃO RETROVIRAL A inserção casual do DNA no genoma das células hospedeiras pode : inativar um gene importante: morte celular ativar um oncogene: alterar o padrão normal de controle e divisão celular  câncer causar mutação

23 Adenovírus Desvantagens Vantagens:
- Infectam grande variedade de tecidos; - Não possuem envelope, sua partícula é muito estável, sendo obtidos em grande quantidade; - DNA dupla fita; - Não se integram no DNA das células hospedeiras; Aceitam inserções de 30Kb; Penetram em células que não se multiplicam; Não ativam proto-oncogene ; Desvantagens - Não é integrado ao genoma celular; - Resposta imune contra o tecido transduzido com o vetor. - Baixa taxa de entrega in vivo expressão transitória Vetor mais utilizado em terapia gênica contra o câncer

24 Pré-Requisitos : Terapia Gênica
escolher a doença apropriada a ser tratada identificar e clonar o gene e suas regiões reguladoras assegurar que o gene inserido não tenha efeitos prejudiciais determinar as células-alvo certas que tenham duração de vida adequada verificar se a técnica é segura e eficiente para a introdução do gene nas células restringir a transferência do gene às células alvo somáticas documentar e divulgar os resultados obtidos

25 Classes de Doenças Passíveis de Terapia Gênica
Doenças Hereditárias (monogênicas - AR) Neoplasias Doenças infecciosas (AIDS) Outras Doenças: doença arterial coronária; artrite; doença renal, etc Mais de 1650 protocolos aprovados

26

27 Algumas tentativas de terapia gênica :
Deficiência da enzima desaminase de adenosina (ADA) Imunodeficiência combinada severa ligada ao X (XSCID) Fibrose Cística Hemofília DMD Hipercolesterolemia Familial: LDLR (receptor de lipoproteína de baixa densidade) Doença de Parkinson e artrite Câncer AIDS

28 Deficiência da Desaminase de Adenosina - (ADA)
Doença imunológica rara: debilitação do sistema imune (imunodeficiência) Enzima ADA: via purinas (tóxica) linfócitos T (células-alvo) são muito acessíveis grande variação no nível de expressão do gene ADA entre indivíduos normais o primeiro protocolo aprovado para terapia gênica foi para a correção da deficiência da ADA. 1990: Drs. Anderson e Blease (Ashanti De Silva)

29 ADA linfócitos T foram coletados e expandidos em cultura ex vivo infectadas com retrovírus recombinante os linfócitos foram injetados nos pacientes expressão do gene ADA detectada por 12 anos nos linfócitos periféricos transferência do gene não foi eficiente: receberam PEG-ADA (enzima exógena)

30 DEFICIÊNCIA DA DESAMINASE DE ADENOSINA - ADA
NOVA TÉCNICA: gene ADA transferido para células tronco: sangue do cordão umbilical 10% dos linfócitos T circulantes carregavam o gene normal tratamento com enzima ADA exógena (PEG-ADA) foi removida progressivamente Células T expressando ADA  significantemente

31 IMUNODEFICIÊNCIA COMBINADA SEVERA LIGADA AO X - XSCID
Devido mutação do gene IL2RG: codifica a cadeia  do receptor IL-2 Pacientes faltam células T e células B prejudicadas França: 10 crianças selecionadas para terapia gênica: células da medula óssea retrovírus 9/10 crianças apresentaram células T com o gene transduzido Duas crianças desenvolveram leucêmia de células T ~ 3 anos após a terapia inserção do retrovírus próximo ao promotor do oncogene LMO2 (fator de crescimento)

32 FIBROSE CÍSTICA gene mutante: CFTR - 7q31-32 (AR)
FIBROSE CÍSTICA gene mutante: CFTR - 7q31-32 (AR) proteína reguladora de condutância transmembrana: transporte de Cl- diminuído e do Na+ aumentado afeta as glândulas exócrinas: problemas respiratórios, digestivos e pancreáticos

33 Fibrose Cística vetor adenoviral: infecta os pulmões, penetra em células que não estão em divisão sem integrar no seu DNA, permitindo que estas expressem o DNA viral, introduzido pelo nariz com um spray (terapia in vivo) desvantagem: inflamação com ataque imune que neutraliza as células contendo gene adenoviral; efeito da terapia de vida curta, cerca de 6 semanas

34 TERAPIA GÊNICA DA HEMOFILIA
Mutação no gene do fator VIII de coagulação afeta 1:5000 homens (recessiva ligada ao X) Sintomas: sangramento espontâneo nas juntas, nos tecidos moles e órgãos vitais Tratamento: injeções regulares de fator VIII

35 TERAPIA GÊNICA DA HEMOFILIA
6 pacientes submetidos à terapia gênica Procedimento: extração de células da pele (fibroblastos) inserção do gene normal em plasmídeo (não provocam rejeição pelo organismo) inseridos nos fibroblastos por choque elétrico clonagem dos fibroblastos pacientes receberam implantes dos fibroblastos no abdomem, após pequenas incisões aumento de 1 a 4% do fator VIII (melhora qualidade de vida dos pacientes) benefícios foram temporários: apenas 10 meses

36 Terapia Gênica - Cegueira
Abril/2008: Universidade da Pennsylvania e Hospital da Philadelphia (USA) e Universidade de Londres: trataram pacientes adultos jovens com neuropatia óptica de Leber (LCA2)  defeito no pigmento do epitélio da retina Inserção do gene RPE65 (injeção com vetor viral direto na retina): codifica a enzima que auxilia na conversão da vitamina A para rodopsina A (pigmento das células fotorreceptoras que absorvem luz)

37 Terapia Gênica - Cegueira

38 Terapia Gênica - Cegueira
Após a terapia mostraram melhora na visão: maior sensibilidade a luz, detectaram movimentos manuais e leitura de linhas de um cartaz de exame oftalmológico Perspectiva: terapia em crianças c/LCA2 e retinoblastoma

39 Exemplo de Terapia Somática
Lewis, R., 2004.

40 VÍTIMA DE TERAPIA GÊNICA
Universidade de Pensilvania:rapaz de 18 anos faleceu durante triagem de TERAPIA GÊNICA  faleceu 4 dias após a terapia  falência múltipla de órgãos Doença: deficiência de ornitina transcarbamilase (OTC): doença ligada ao X  distúrbio do ciclo da uréia (fígado)  causa níveis impróprios de amônia no sangue Vetor adenoviral (alta dose- 38 trilhões de adenovírus)  injeção no fígado  altos níveis de IL-6  consequências sistêmicas  síndrome de resposta inflamatória sistêmica letal

41 VÍTIMA DE TERAPIA GÊNICA
Julho/2007: mulher de 36 anos com artrite reumatóide faleceu 22 dias após receber a segunda dose de um gene terapêutico para artrite. Após investigação pela FDA não foi possível atribuir a morte da paciente a terapia

42 TERAPIA GÊNICA DO CÂNCER
Introdução de genes supressores de tumor para restaurar a função perdida. Ex.: inserção do gene TP53 normal em tumores de pulmão  bloquear a progressão tumoral e apoptose

43 Terapia Gênica do Câncer – Imunoterapia ou Vacinas de câncer
Células de melanoma do paciente cancerosas são removidas, recebem genes de interleucinas Genes de interleucinas expressam Paciente Resposta Imune Tumores diminuíram Imunoterapia: introdução de lipossomos com DNA para HLA-B27 em melanoma: expressão de HLA-B27 na superfície das células e destruição pelas células T citotóxicas  regressão do melanoma em alguns casos

44 TERAPIA GÊNICA DO CÂNCER
Terapia pró-droga ou gene suicida: transferência de um gene (HSV-tk) → tirosina quinase → que ativam pró-drogas → tornam as células em divisão sensíveis a drogas selecionadas Glioma é um tipo de tumor cerebral que afeta as células da glia que suportam e interagem com os neurônios; Célula da glia pode se dividir e cancerosa se divide muito rápido; Um gene suicida na presença de um droga é ativado e mata as células que o contêm.

45 TERAPIA PRÓ-DROGA – GENE SUICIDA

46 Terapia Gênica no Brasil
Em 2004 foi criada a Rede de Terapia Gênica 27 institutos ou Departamentos de 6 estados (Rio de Janeiro, São Paulo e Rio Grande do Sul), financiados pelo Institutos do Milênio do CNPq/MCT. Pesquisas: introdução de genes com efeito terapêutico Qual o alvo do Brasil? - terapia gênica em câncer - doenças graves do metabolismo - doenças degenerativas e cardiovasculares - vacinas de DNA profiláticas para doenças infecciosas e vacinas de DNA terapêuticas para HPV

47 Terapia Gênica no Brasil
Rede é composta por: Rio de Janeiro: o Instituto de Biofísica da UFRJ, o Instituto Oswaldo Cruz e o Instituto Nacional do Câncer (INCA); São Paulo: os Departamentos de Microbiologia e Biologia Celular e Desenvolvimento da USP, o CINTERGEN da UNIFESP, o InCor e o Instituto Butantã; Rio Grande do Sul: os Departamentos de Genética e de Biofísica e o Hospital de Clínicas da UFRGS, bem como o Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul.

48 Terapia Gênica no Brasil
1o. Estudo Clínico em pacientes cardíacos (isquemia) – fases 1 e 2 (segurança e eficácia) Coordenado pelo Dr. Renato Karan Kalil – Inst. Cardiologia do Rio Grande do Sul Grupo de 10 pacientes tratados com injeção de DNA (plasmídeo c/gene VEGF-165) diretamente no coração  estimula angiogênese 8 pacientes apresentaram bons resultados: -aumento na capacidade de bombear sangue -desempenho em testes de esforço físico                         

49 NANOTECNOLOGIA

50 NANOTECNOLOGIA -Tamanho: 10-100nm (um bilionésimo de metro)
- minúsculas partículas: variadas formas  tubos, conchas, espirais -Composição: moléculas funcionais como: drogas, peptídeos, proteínas, ácidos nucléicos -materiais: polímeros, dendrímeros, lipossomos, nanotubos de carbono, e metais (ouro e óxido de ferro) -Polímeros: avaliar a toxicidade (ativação do complemento, imunogenicidade, carcinogenicidade, teratogenicidade)  devem ser não tóxicos e biodegradáveis  evitar acúmulo no organismo (fígado, baço e medula óssea)

51 NANOTECNOLOGIA minúsculas partículas: variadas formas  tubos, conchas, espirais nano: um bilionésimo de metro. Nanoconchas: cheias de partículas de ouro  destroem células tumorais quando aquecidas com a luz de um raio laser  interagem com a luz de forma específica  "configuradas" para destruir sob a ação de comprimentos de onda específicos Nanotubo: combinado com anticorpos monoclonais, detecta células cancerosas  alternativa rápida para diagnosticar células cancerosas.

52 NANOTECNOLOGIA Nanoconchas - esferas microscópicas  núcleo de sílica, recoberto com uma finíssima camada de ouro e, em segundo lugar, luz com comprimento de onda na faixa do infravermelho. injetaram nanoconchas na corrente sangüínea de camundongos com câncer de cólon  as nanoconchas se acumulam preferencialmente nos tumores (vasos mal formados e permeáveis)  irradiação dos tumores com fonte de laser  82% dos camundongos sobreviveram

53 NANOTECNOLOGIA ”Imunonanoconchas”: nanoconcha direcionável possa encontrar um tipo específico de câncer, onde quer que ele possa estar escondido conectaram anticorpos anti-HER2 em nanoconchas  aplicaram essas imunonanoconchas sobre células de câncer de mama (em laboratório)  utilizaram raios laser para aquecer o agente. -Coraram as células  somente morreram as células de expressão do HER2 que tinham sido ligadas a nanoconchas Células que não foram expostas ao câncer também sobreviveram, sugerindo que o tratamento anticorpo- nanoconcha efetivamente destrói as células cancerosas HER2+.

54 NANOTECNOLOGIA ”Nanocomplexo”: liposomo + anticorpo, junto com terapia genética  irá tanto detectar quanto alvejar células metastatizadas de câncer, destruindo-as. liposomo encapsula o gene p53  ativa apoptose nas células com danos genéticos. O complexo liposomo-anticorpo  encontra a célula cancerosa  ligando-se ao receptor transferrina (presente em grande número na superfície das células cancerosas). Terapia : melhorou o tratamento do câncer por quimioterapia e radiação  morte das células danificadas  nanocomplexo atinge somente as células cancerosas

55 NONOEMULSÃO MULTIFUNCIOANAL - NONOTERANÓSTICO
Nanopartícula de óxido de ferro em emulsão água-óleo carregando um fluoróforo (imagem guiada) e droga terapêutica, após injeção intravenosa para alvejar câncer de cólon em ratos. Adv Mater . Author manuscript; available in PMC 2012 September 22.

56 Nanopartículas alvo-dirigidas em estudos pré-clínicos e clínicos
SGT-53: lipossomo contendo plasmídeo com o gene TP53  tem como alvo receptor de transferrina  alta expressão em células cancerosas.

57 Nanopartículas e toxicidade
Apesar do uso de nanopartículas até mesmo para consumo há poucas informações sobre os possíveis efeitos tóxicos para a saúde humana e o meio ambiente Efeitos já observados: Catalisar danos oxidativos ao DNA Nanopartículas de ouro: têm a capacidade de mover-se através da placenta da mãe para o feto quando injetadas em ratas grávidas - Nanopartículas de prata: Granulomas em ratos e camundongos após a exposição aguda Nanotubos de carbono: causam acelerado estresse oxidativo na pele Pouca atenção tem sido dada aos efeitos ambientais